丁新 鄭勇 李靜 鄭雪 童娟娟 楊丹平 陳衛(wèi)剛

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（新疆石河子832000）

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)我國流行病學(xué)顯示其5年生存率僅為18.4%［1］。由于食管癌的標(biāo)準(zhǔn)療法仍局限于手術(shù)或內(nèi)窺鏡切除和化學(xué)放射治療，因此需要更好地揭示食道癌的分子發(fā)病機(jī)理以開發(fā)新的生物標(biāo)記物和靶向療法［2］。隨著研究的進(jìn)展，越來越多的證據(jù)表明長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的表達(dá)失調(diào)存在于多種惡性腫瘤之中，并在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、特異性診斷、靶點治療等方面起著重要的作用，但尚未鑒定出特異性lncRNA 用作食管癌早期診斷及預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物。本課題組李光華等［3］通過基因芯片技術(shù)對食管鱗癌及其癌旁正常組織中差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)XLOC_009038 表達(dá)明顯上調(diào)，提示該基因可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系。為進(jìn)一步驗證XLOC_009038 在食管癌中的作用，本研究通過干擾食管鱗癌細(xì)胞EC109、EC9706 中XLOC_009038 的表達(dá)，觀察干擾前后細(xì)胞體外增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)特性的變化并探討其作用機(jī)制，為食管鱗癌的發(fā)生及防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料食管鱗狀細(xì)胞癌EC109、EC9706 細(xì)胞株于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院重點實驗室留存。質(zhì)粒購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；實時定量PCR 引物由上海生工構(gòu)建；LipofectaminTM2000 由美國Invitrogen 公司提供；胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自Gibco 公司；Trizol 試劑購于Invitrogen 公司；qRT-PCR 試劑購于康為公司；Transwell 小 室、Matrigel 膠 均 購 自 美 國Corning 公 司。Western blot 抗體購于Abcam 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用含有10%胎牛血清及青鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基。于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度在80%時進(jìn)行傳代或用凍存液凍存于液氮中保存。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染針對XLOC_009038 基因序列構(gòu)建干擾質(zhì)粒，質(zhì)粒序列S1：5'-AACCAGCTATGCGG ACACATT-3'；S2：5'-CAGGCTATTGGTTGCCTGGAA-3'；S3：5'-TAGCCTACAGAGACCCATTCT-3'。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)以3 × 105個/孔均勻鋪至六孔板中，待匯合度達(dá)80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒與Lip2000 濃度為5 μg：8.5 μL，加無血清培養(yǎng)基至2 mL 每孔，轉(zhuǎn)染后5 h 更換完全培養(yǎng)基。實驗組（experience group）轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒，對照組（control group）轉(zhuǎn)染空載陰性質(zhì)粒。

1.4 實時定量PCR 驗證轉(zhuǎn)染效果轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，Trizol 裂解細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測XLOC_009038 干擾效率，篩選出下調(diào)效果最佳的質(zhì)粒，GAPDH 為內(nèi)參。XLOC_009038 基因上游引物為5'-ACCAGCTATGCGGACACATTGATG-3'，下游引物為5'-GAGGCAGGAGAATCGCTTGAACC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度194 bp；內(nèi)參上游引物為5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，下游引物為5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度151 bp。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性45 s、57 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。利用2-△△Ct法計算XLOC_009038相對表達(dá)量。

1.5 MTT 比色法檢測細(xì)胞增殖能力將上述實驗組和對照組細(xì)胞接種于96 孔板（3 000 個/孔），每組設(shè)置5 個復(fù)孔。培育0、24、48、72 h 時在每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），培養(yǎng)箱孵育4 h，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，搖床低速振蕩10 min充分溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 處測量各孔的吸光值。

1.6 平板克隆形成實驗調(diào)整細(xì)胞濃度接種于六孔板（3 000個/孔）。培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 d后PBS洗滌細(xì)胞集落，多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min。計數(shù)超過50 個細(xì)胞的集落。

1.7 Transwell 測定細(xì)胞遷移、侵襲實驗用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞濃度至2×105個/mL，取150 μL細(xì)胞懸液接種至transwell 上層小室，下層小室放20%完全培養(yǎng)基800 μL。36 h 后取出上層小室，固定染色，計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實驗在上層小室鋪1∶8 稀釋的Matrigel 膠70 μL 孵育4 h，余同遷移實驗。

1.8 流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞凋亡率取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞胰酶消化，離心后去上清，PBS 洗滌2 次，加入緩沖液100 μL，5 μL Annexin V-FITC 染色液和10 μL PI 染色液，常溫孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.9 Western blot 檢測procaspase3 表達(dá)用RIPA裂解液提取蛋白，100 ℃變性13 min。取20 μL 蛋白液電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。封閉2 h后，加入caspase3 一抗（1∶1 000）、β-actin 一抗（1∶10 000）孵育過夜。加入山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，發(fā)光試劑顯色，曝光。用Photoshop CS5 軟件測定條帶的灰度值，計算XLOC_009038的相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較時數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用獨立樣本檢驗，不符合正態(tài)分布時采用非參數(shù)檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)資料以表示。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后EC109、EC9706 細(xì)胞中XLOC_009038表達(dá)降低各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，EC109、EC9706兩實驗組中XLOC_009038 表達(dá)量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義［（t= 10.227，P＜0.001）；（t=6.97，P=0.001），圖1］。

圖1 各組細(xì)胞中XLOC_009038 基因的表達(dá)Fig.1 Expression of XLOC_009038 gene in each group of cells

2.2 低表達(dá)XLOC_009038可抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖能力MTT 實驗表明，細(xì)胞EC9706 轉(zhuǎn)染24 h 后實驗組OD值開始低于對照組（t=8.21，P＜0.001）。細(xì)胞EC109 在轉(zhuǎn)染后24 h 后實驗組OD 值開始低于對照組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，于48 h 出現(xiàn)明顯抑制（t=9.59，P＜0.001，圖2A）；生長曲線顯示兩株細(xì)胞的實驗組干擾XLOC_009038 后生長速度慢于對照組（圖2B）?？寺⌒纬稍囼灲Y(jié)果顯示，實驗組EC109 細(xì)胞克隆形成率為（7.54 ± 2.14）%，顯著低于對照組（13.04 ± 0.60）%（t= 4.26，P= 0.013）；實驗組EC9706 克隆形成率為（9.38 ± 0.84）%，對照組克隆形成率為（11.75 ± 0.35）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.50，P=0.011）（圖3）。

圖2 MTT 檢測各組細(xì)胞增殖能力結(jié)果Fig.2 The results of proliferation abilities in the various groups

圖3 克隆形成實驗結(jié)果Fig.3 The results of clone formation experiment in the various groups

2.3 低表達(dá)XLOC_009038 可抑制食管鱗癌細(xì)胞遷移、侵襲能力Transwell 實驗顯示，細(xì)胞EC109實驗組與對照組穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（55.20 ±8.90）和（167.80 ± 9.91），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=18.90，P＜0.001）；實驗組對照組相比穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少［（44.80 ± 9.60）vs.（72.80± 7.26）；t= 5.20，P= 0.002］。在細(xì)胞EC9706 實驗組遷移細(xì)胞數(shù)（52.20 ± 9.04）明顯少于對照組（108.80 ± 6.38），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 11.44，P＜0.001）；對照組穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)為（130.80±15.54）明顯多于實驗組（57.20±15.43），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.51，P＜0.001）（圖4、5）。

圖4 各組細(xì)胞Transwell 遷移實驗結(jié)果（×200）Fig.4 Results of migration experiments in the various groups（×200）

圖5 各組細(xì)胞Transwell 侵襲實驗結(jié)果（×200）Fig.5 Results of invasive experiments in the various groups（×200）

2.4 下調(diào)XLOC_009038 可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況，轉(zhuǎn)染48 h 后EC109 實驗組與對照組細(xì)胞相比凋亡率增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義［（11.43 ± 1.06）vs.（19.53±0.85）；t=10.32，P＜0.001］。EC9706 實驗組與對照組凋亡率分別為（6.6 ± 0.62）和（16.93 ±1.27），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.61，P＜0.001）。通過對流式結(jié)果圖的分析顯示，干擾XLOC_009038后細(xì)胞凋亡變化主要發(fā)生在Q2 象限（圖6）。

2.5 低表達(dá)XLOC_009038 可促進(jìn)Procaspase3 蛋白表達(dá)Western blot 檢測結(jié)果顯示，48 h 時EC109對照組與實驗組相對灰度值分別為（0.74 ± 0.13）和（1.09 ± 0.03），EC9706 對照組與實驗組相對灰度值分別為（0.56 ± 0.03）和（1.06 ± 0.31），兩種細(xì)胞的實驗組相對灰度值與對照組相比均明顯增高（t=0.013；P＜0.001）差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖7）。

圖6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果Fig.6 Experimental results of apoptosis detected by flow cytometry

圖7 各組食管鱗癌細(xì)胞中procaspase3 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平Fig.7 The different protein expression of procaspase3 in the various groups

3 討論

我國是世界上食管癌新發(fā)病例最多的國家，發(fā)病率呈明顯的地區(qū)差異［4］。盡管近年來內(nèi)鏡技術(shù)、影像技術(shù)在食管癌的早期診斷治及療中起到了明顯的效果，但其敏感性、特異性及經(jīng)濟(jì)支出等問題造成了一定的局限性，食管癌患者5年生存率依舊很低。因此為提高診斷和治療水平，對新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物的需求更為迫切。

近年來隨著對lncRNA 研究的深入，人們對它的認(rèn)識也從轉(zhuǎn)錄“噪音”轉(zhuǎn)變?yōu)樵诙喾N疾病中發(fā)揮不同作用的調(diào)控物質(zhì)［5］。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA 在免疫應(yīng)答、增殖分化、蛋白修飾調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。同時一些lncRNA 可在腫瘤發(fā)生過程中可作為原癌基因或抑癌基因發(fā)揮其生物學(xué)特性［6］，如HOTAIR已作為一種潛在的生物學(xué)標(biāo)志進(jìn)入了人們的視野，對腫瘤的早期診斷有重要價值［7］。LncRNA 功能復(fù)雜多樣，但主要作用是調(diào)節(jié)鄰近蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)的獨特功能［8］，ZHANG 等［9］研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1 可與miR-7 相互作用調(diào)節(jié)HOXB13蛋白的表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的生長和遷移。長鏈非編碼RNA 以其復(fù)雜的生物學(xué)功能在代謝性疾病、腫瘤等多種疾病中起到重要的作用，對其深入研究將為疾病的特異性診斷、靶點治療等發(fā)面提供新的契機(jī)。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個動態(tài)、連續(xù)的過程，在此過程中涉及腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲及血管形成等。細(xì)胞凋亡調(diào)控異常造成細(xì)胞過度積累是癌癥發(fā)生的機(jī)制之一，癌細(xì)胞向周圍組織和脈管系統(tǒng)中遷移和侵襲是癌轉(zhuǎn)移的一個重要初始步驟，為癌癥相關(guān)死亡的主要原因［10］。本課題組利用基因芯片技術(shù)對食管鱗癌及其癌旁組織中l(wèi)ncRNA 進(jìn)行全面分析，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)XLOC_009038（ID：TCONS_00019203）定位于chr19，長度為376 bp。其在癌組織中的高表達(dá)（FC = 5.08，P= 0.02）預(yù)示著在食管鱗癌癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。在本研究中干擾XLOC_009038 使其表達(dá)下調(diào)后觀察到兩株細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力明顯下降，表明該基因可能扮演者促癌基因的角色，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在精準(zhǔn)醫(yī)療的大背景下，靶向抑制該基因可為治療食管癌提供新的思路。

本研究干擾XLOC_009038 后Procaspase3 在細(xì)胞中的表達(dá)量增加，預(yù)示著XLOC_009038 的高表可通過抑制caspase3 的表達(dá)在食管癌細(xì)胞的生長過程中發(fā)揮作用。Caspases 是一類半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，caspase3 在凋亡過程中是核心地位的效應(yīng)因子。正常情況下的caspase3 以無活性的形式存在，一旦損傷因素導(dǎo)致凋亡發(fā)生，Procaspase3即被激活誘發(fā)下游的級聯(lián)反應(yīng)，降解與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號通路、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 修復(fù)等功能相關(guān)的蛋白使細(xì)胞產(chǎn)生不可避免的死亡。同時，多項研究結(jié)果表明，高caspase-3 表達(dá)與惡心腫瘤患的者生存率相關(guān)［11］。本研究顯示，通過干擾質(zhì)粒抑制XLOC_009038 的表達(dá)后，細(xì)胞晚期凋亡率出現(xiàn)明顯的增高，同時western blot 顯示實驗組Procaspase3 表達(dá)量增多，由此可推測XLOC_009038 過表達(dá)時可能抑制Procaspase3 影響細(xì)胞凋亡途徑的正常進(jìn)行，造成細(xì)胞過度積累而導(dǎo)致食管癌的發(fā)生發(fā)展。然而，XLOC_009038 是直接調(diào)控Procaspase3 的生成還是影響Procaspase3 活化為cleavedcaspase-3 的過程尚待進(jìn)一步研究。

本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，首次證實了XLOC_009038 在食管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著一定的角色，在細(xì)胞分子生物學(xué)層面為揭示食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展提供新的理論依據(jù)。但該研究尚存在一定的局限性，如本研究為體外細(xì)胞學(xué)實驗，未進(jìn)一步在病理樣本、裸鼠等進(jìn)行體內(nèi)實驗驗證XLOC_009038 在食管癌中的作用。本課題組后期將擴(kuò)大食管鱗癌樣本數(shù)量來進(jìn)一步驗證XLOC_009038 在食管鱗癌中表達(dá)的變化，同時探究XLOC_009038 在血清或血漿標(biāo)本中表達(dá)的變化，并通過隨訪判定其在食管鱗癌診斷和預(yù)后預(yù)測的應(yīng)用價值，為XLOC_009038 作為診斷標(biāo)志物提供更多的理論依據(jù)。繼續(xù)尋找XLOC_009038 下游靶基因（蛋白），探討XLOC_009038 在食管鱗癌組織中表達(dá)升高的原因，以期更加明確地闡明XLOC_009038 在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

總之，本研究表明高表達(dá)的XLOC_009038 可能通過抑制Procaspase3 促進(jìn)食管鱗癌癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著類似于原癌基因的角色，對其深入研究有望成為食管癌新的生物標(biāo)志物和食管癌預(yù)防治療的新靶點。