蔣珍鳳 王恩智 童夏生

天然免疫是機(jī)體的第一道防御系統(tǒng)，在感染性和非感染性疾病中都起著重要作用[1-2]。病毒或微生物感染后，機(jī)體的天然免疫反應(yīng)會被激活，病原體相關(guān)分子模式通過不同的模式識別受體識別和清除病原微生物。模式識別受體包括Toll樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體和維甲酸誘導(dǎo)基因-I（RIG-I）樣受體等家族[3]。嬰幼兒期呼吸道感染最常見的疾病之一，大多由病毒感染引起，主要為呼吸道合胞病毒（RSV）和流感病毒。研究發(fā)現(xiàn)，模式識別受體與呼吸道病毒感染有關(guān)，但RIG-I樣受體家族RIG-I和黑素瘤分化關(guān)聯(lián)基因5（MDA-5），與嬰幼兒呼吸道病毒感染的相關(guān)性研究較少[4]。本研究通過觀察RSV感染的毛細(xì)支氣管炎和流感病毒感染的急性上呼吸道感染患兒血清RIG-I和MDA-5濃度的變化，探討模式識別受體在呼吸道感染的不同部位及不同種類病毒感染中的作用，為嬰幼兒呼吸道病毒感染的發(fā)病機(jī)制和可能的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2016年11月—2017年4月臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的住院患兒90例，均符合毛細(xì)支氣管炎或急性上呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。本研究取得患者家屬知情同意，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合毛細(xì)支氣管炎或急性上呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)；毛細(xì)支氣管炎組血清RSV均呈陽性表達(dá)，急性上呼吸道感染組流感病毒均呈陽性表達(dá)（采用間接免疫熒光法檢測，試劑盒購自西班牙VIRCELL，S.L公司）；病程24～48h；毛細(xì)支氣管炎組住院時間為12～14d。排除標(biāo)準(zhǔn):合并有嚴(yán)重心、肝、腎等重大臟器疾??；甲狀腺疾病等免疫性疾病史；惡性腫瘤；2周內(nèi)有感染病史；最近2周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素。

2 方法

2.1 標(biāo)本采集 采集患兒靜脈血各2mL，急性上呼吸道感染組和對照組在就診時采集，毛細(xì)支氣管炎組分別于患兒就診時（急性期）和治療后（恢復(fù)期）采集，標(biāo)本靜置2h后分離血清（3000r/min離心15min），置于-80℃冰箱貯存，集中檢測。

2.2 血清RIG-I和MDA-5蛋白檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，檢測血清RIG-I和MDA-5的蛋白濃度。操作方法：試劑盒和96孔反應(yīng)板置于室溫，先后在反應(yīng)孔里加入標(biāo)品40μL、RIG-I和MDA-5抗體各10μL、混勻、置37℃溫育30min、洗滌、酶標(biāo)試劑50μL、顯色劑 A 50μL、顯色劑B 50μL、37℃避光顯色 15min、加終止液 50μL，全自動酶標(biāo)儀450nm波長測量各孔的吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的濃度。RIG-I和MDA-5試劑盒均購自Bio-Gram 公司（生產(chǎn)批號 SU-B11924、SU-B10697），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清RIG-I和MDA-5蛋白表達(dá)濃度（靈敏度：最低檢測濃度＜0.1ng/mL）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhame’s T2檢驗(yàn)，同組比較采用配對資料的t檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（雙側(cè)檢驗(yàn)）。

3 結(jié)果

3.1 三組研究對象一般資料比較 毛細(xì)支氣管炎（毛細(xì)支氣管炎組）46例，男22例，女24例；年齡0.5～3歲，平均（1.62±0.84）歲；急性上呼吸道感染（急性上呼吸道感染組）44例，男18例，女26例，年齡0.3～3歲，平均（1.54±0.88）歲。對照組 44例來自同期在溫嶺市衛(wèi)生進(jìn)修學(xué)校兒科門診健康體檢兒童，男23例，女 21例，年齡 0.3～3歲，平均（1.47±0.77）歲。三組患兒性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 三組研究對象血清RIG-I和MDA-5表達(dá)水平比較 毛細(xì)支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度均顯著高于對照組（P均＜0.01）；毛細(xì)支氣管炎組急性期血清RIG-I蛋白濃度顯著高于急性上呼吸道感染組（P＜0.05），兩組間MDA-5蛋白濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。毛細(xì)支氣管炎組恢復(fù)期血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度均顯著低于急性期（P均＜0.01）。見表1。

表1 三組呼吸道感染嬰幼兒血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度比較（ng/mL，±s）

表1 三組呼吸道感染嬰幼兒血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度比較（ng/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與急性上呼吸道感染組比較，△P＜0.05；與同組急性期比較，▲P＜0.01；RIG-I：維甲酸誘導(dǎo)基因-I；MDA-5：黑素瘤分化關(guān)聯(lián)基因5

組別對照組急性上呼吸道感染組毛細(xì)支氣管炎組急性期恢復(fù)期F值P RIG-I 5.43±1.77 12.37±4.16*MDA-5 7.42±2.07 15.50±4.29*14.60±4.05△*9.94±4.14▲82.63＜0.01 18.19±6.95*12.98±5.54▲58.30＜0.01

3.3 相關(guān)性分析 RIG-I和MDA-5表達(dá)呈顯著直線正相關(guān)（r=0.52，n=134，P＜0.01）。

4 討論

細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體由RIG-I樣受體蛋白家族組成，主要成員為RIG-I和MDA-5，兩者在形態(tài)學(xué)上具有高度同源性，包括2個N-末端半胱氨酸蛋白酶募集反應(yīng)結(jié)構(gòu)域和解螺旋酶結(jié)構(gòu)域和C-未端抑制結(jié)構(gòu)域，并通過共同的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)觸發(fā)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)[6]。在細(xì)胞質(zhì)中，RIG-I具有5′端成族的三磷酸鹽的結(jié)構(gòu)，而MDA-5活性結(jié)構(gòu)是具有較長的雙鏈RNA，在外源性的RNA誘導(dǎo)下發(fā)生一連串的級聯(lián)反應(yīng)，包括干擾素β和核轉(zhuǎn)錄因子κB，產(chǎn)生I型干擾素和促進(jìn)天然免疫反應(yīng)[6]。通常，RIG-I樣受體蛋白家族分享檢測病毒感染的分子信號結(jié)構(gòu)，目前已證實(shí)家族成員間在抗病毒的過程中具有協(xié)同作用[7]。RIG-I信號由自身細(xì)小的核糖核酸酶分解產(chǎn)物所激活，識別相對較短的雙鏈RNA（小于1kb），MDA5 識別長的雙鏈 RNA（大于 2kb）。由于RIG-I和MDA-5是屬于細(xì)胞質(zhì)的解螺旋酶類，具有認(rèn)識特殊的非自身的抗病毒RNA標(biāo)記物，能通過線粒體銜接蛋白信號通路促發(fā)抗病毒的免疫反應(yīng)，起到抗病毒作用，達(dá)到控制和清除病原體，減輕炎癥反應(yīng)、預(yù)防免疫介導(dǎo)的組織損傷的作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清RIG-I蛋白的濃度在毛細(xì)支氣管炎組急性期高于急性上呼吸道感染組且高于對照組（P＜0.01），提示模式識別受體RIG-I在病毒感染后提升，不同的感染部位或不同病毒其表達(dá)水平也不一樣，支持RIG-I通過提升其表達(dá)水平起到清除病原體的作用。在毛細(xì)支氣管炎組，隨著病情的恢復(fù)RIG-I水平也隨之下降，提示在疾病的不同階段RIG-I的表達(dá)也不同，表明它與病情相關(guān)。相似的結(jié)果也見于其他的研究，在流感A型病毒感染后，肺組織RIG-1 mRNA的表達(dá)水平下降，認(rèn)為肺組織損傷、凋亡和水通道的改變與RIG-信號通路有關(guān)[9]。在RSV感染小鼠后，肺組織RIG-I和MDA-5蛋白表達(dá)水平也增加，與肺組織蛋白酶類表達(dá)增加相關(guān)[10]。病毒感染的鼻炎患者鼻部上皮細(xì)胞的Toll樣受體、RIG-I和MDA-5的表達(dá)增強(qiáng)，共同參與識別和清除由于病毒入侵引起的炎癥反應(yīng)，其表達(dá)水平與病毒誘導(dǎo)的鼻黏膜炎癥加重有關(guān)，其機(jī)制可能是促進(jìn)鼻黏膜分泌增加IFN-β[11]。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組血清MDA-5蛋白的濃度均高于對照組（P＜0.01），提示MDA-5也隨病毒感染后提升，支持MDA-5能通過提升其表達(dá)水平起到清除病原體的作用。在毛細(xì)支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組MDA-5蛋白的濃度無差別，提示MDA-5對RSV和流感病毒的感染反應(yīng)沒有特異性。在毛細(xì)支氣管炎組恢復(fù)期，MDA-5蛋白的濃度低于急性期，支持MDA-5水平與病情相關(guān)，隨著病情的恢復(fù)也隨著下降。MDA-5表達(dá)水平變化也見于其他的報道。在小鼠鼻內(nèi)接種流感病毒A型后3天，病毒感染的癥狀加重，鼻黏膜RIG-I和MDA-5的mRNA和蛋白濃度顯著增加[12]。通過相關(guān)分析，RIG-I和MDA-5表達(dá)呈顯著直線正相關(guān)（P＜0.01），提示模式識別受體之間具有協(xié)同作用，共同參與病毒感染的炎癥機(jī)制。

綜上所述，在呼吸道感染嬰幼兒血清模式識別受體RIG-I和MDA-5表達(dá)增加，可能共同參與清除病毒感染，其表達(dá)水平隨著病情恢復(fù)而相應(yīng)下降。[本研究受浙江省溫嶺市科技局基金資助項(xiàng)目（No.2015-1-58）支持。第一作者蔣珍鳳現(xiàn)單位為溫嶺市中醫(yī)院兒科。]