賴河青

口腔癌是復(fù)雜、多基因、多階段的病理過程，其發(fā)病機(jī)制尚未明確[1-2]。微小RNA（miRNA）表達(dá)的改變影響腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤進(jìn)展的多個(gè)階段，并在癌癥細(xì)胞的發(fā)生、凋亡，轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[3-5]。miR-20a是miR-17前體家族的成員，參與了多項(xiàng)腫瘤細(xì)胞增殖，遷移和侵襲。初步研究表明miR-20a過表達(dá)與前列腺癌、胃癌、甲狀腺未分化癌癥密切相關(guān)[6-9]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）可誘導(dǎo)PKA過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和集落形成[10]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）、 細(xì) 胞 周 期 調(diào) 控 因 子（cyclyinD1，cyc D1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是參與腫瘤增殖的重要細(xì)胞因子，也是miRNA-20a、BCL-2調(diào)控下的細(xì)胞因子[11-12]。研究證實(shí)，雷公藤紅素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[13]。平陽霉素能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且其在細(xì)胞凋亡、慢性炎癥、血管生成過程中均發(fā)揮重要作用[14]。本研究擬探討miRNA-20a-BCL-2信號(hào)通路介導(dǎo)雷公藤紅素、平陽霉素對(duì)Tca8113增殖與侵襲，為口腔癌的治療提供理論及臨床依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材 料 Tca8113細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，批號(hào) YY-XB-A0068）。

1.2 藥 品 雷公藤紅素（99.99%，CAS No：34157-83-0，sigma）、平陽霉素（規(guī)格：10g，批號(hào) 16548796，日本Takara公司）。

1.3 主要儀器與試劑 倒置顯微鏡（DMI3000B，德國(guó)LEICA公司）；熒光定量PCR儀（T100，美國(guó)伯樂公司）；酶標(biāo)儀（MK3，美國(guó)熱電）；胰酶（Merck KGaa，darmstadt，德國(guó)）；DMEM 培養(yǎng)基（規(guī)格 500mL，批號(hào)31600，北京索萊寶科技有限公司）；胰酶（規(guī)格：5mL，批號(hào)8049476，山東豐泰生物科技有限公司）；Trizol試劑（規(guī)格：100mL，批號(hào) 15596026，美國(guó) Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（規(guī)格100t，批號(hào)RR047A，日本Takara公司）；BD BiocoatTMMatrigelTM基質(zhì)（規(guī)格5mL，批號(hào)325260，上海通善生物技術(shù)有限公司）；聚碳酸脂微孔濾膜（規(guī)格25um，批號(hào)15698745，上海正晃商貿(mào)有限公司）；MMP-9、cyc D1、VEGF 蛋白 Elisa試劑盒（規(guī)格96 孔，批號(hào) kit263965483、kit263963654、kit26395465，德國(guó)Merck公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 取10mL濃度為5×106/mL的Tca8113細(xì)胞液于10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)微環(huán)境為：溫度37℃、二氧化碳濃度5%、氧氣濃度20%；雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組（雷公藤紅素+平陽霉素）的培養(yǎng)方法同對(duì)照組，其培養(yǎng)液分別含有雷公藤紅素（20μg/mL）、平陽霉素（20μmol/mL）以及雷公藤紅素（20μg/mL）+平陽霉素（20μmol/mL）。

2.2 RT-PCR法檢測(cè)miRNA-20a、BCL-2 RNA水平 Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定總RNA的濃度和質(zhì)量。然后使用miR-20a、BCL-2特異性反向引物逆轉(zhuǎn)錄總RNA（0.5μg）以獲得cDNAmiR-20a正向引物為：GTCGCCATGCAGGGTCCGAGGTATGCGAC T；miR-20a 反向引物為：CTCGCTTCGACATTGCCTA CGAG；BCL-2 正向引物為：CGACCCATGGACTGAA GGTATGTCGAG；BCL-2 反向引物為：CCTATTTCGA CATCTCGCTACTTAG；（上述引物均有生工生物工程上海股份有限公司合成）。Fast Synergy Brands Green Master Mix法在ABI 7500實(shí)時(shí)qPCR上測(cè)定miR-20a、BCL-2的相對(duì)水平。系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientifc）以 U6 作為內(nèi)部對(duì)照，以 2-ΔΔCt作為計(jì)算方法。

2.3 Tca8113細(xì)胞株細(xì)胞活力及凋亡檢測(cè) MTT法常規(guī)檢測(cè)細(xì)胞活力，DMI3000 B倒置顯微鏡下觀察Tca8113細(xì)胞形態(tài)；Tca8113細(xì)胞株培養(yǎng)48h后，流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡，確定循環(huán)，重復(fù)3次。

2.4 Tca8113細(xì)胞株侵襲能力檢測(cè) 無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至2.5×104/100μL，總共將100μL細(xì)胞懸浮液加入侵襲室的上部隔室，并將500μL補(bǔ)充有10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下部隔室，然后將上隔室置于24孔培養(yǎng)板中，標(biāo)記，蓋上蓋子，進(jìn)行培養(yǎng)。用移液管丟棄上隔室中的培養(yǎng)基，然后將24孔板加入600μL甲醇（4%），用150μL無水甲醇培養(yǎng)15min。之后從上隔室移除絕對(duì)甲醇后，將上隔室置于24孔板中。上隔室的下表面在通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干。加入吉姆薩溶液后，PBS洗滌Transwell室。在倒置顯微鏡下具有高放大倍數(shù)視覺的幾個(gè)隨機(jī)的鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移的數(shù)目。

2.5 Tca8113細(xì)胞株 MMP-9、cyc D1、VEGF 蛋白水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集細(xì)胞液，Elisa法檢測(cè)MMP-9、cyc D1、VEGF 蛋白水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差、相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組Tca8113細(xì)胞抑制率比較 雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組抑制率（%）均高于對(duì)照組（P＜0.05）；聯(lián)合組抑制率（%）高于雷公藤紅素組、平陽霉素組（P＜0.05）。見表 1、插頁圖 1。

表1 各組Tca8113細(xì)胞抑制率比較（%，±s）

表1 各組Tca8113細(xì)胞抑制率比較（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，△P＜0.05；與平陽霉素組比較，▲P＜0.05；聯(lián)合組：雷公藤紅素+平陽霉素

組別對(duì)照組雷公藤紅素組平陽霉素組聯(lián)合組孔數(shù)6 6 6 6抑制率（%）0.00±0.00 72.56±0.98*59.43±0.44*92.44±0.16*△▲

3.2 各組 Tca8113細(xì)胞 miRNA-20a RNA、BCL-2 RNA表達(dá)量比較 雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組miRNA-20a、BCL-2 RNA低于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組 miRNA-20a、BCL-2 RNA低于雷公藤紅素組、平陽霉素組（P＜0.05）；雷公藤紅素組、平陽霉素組miRNA-20a、BCL-2 RNA水平相近（P＞0.05）。見表 2。

表2 各組Tca8113細(xì)胞miRNA-20a RNA、BCL-2 RNA表達(dá)量比較（±s）

表2 各組Tca8113細(xì)胞miRNA-20a RNA、BCL-2 RNA表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，△P＜0.05；與平陽霉素組比較，▲P＜0.05；聯(lián)合組：雷公藤紅素+平陽霉素

組別對(duì)照組雷公藤紅素組平陽霉素組聯(lián)合組孔數(shù)6 6 6 6 miRNA-20a RNA 1.97±0.25 1.53±0.17*1.52±0.20*0.53±0.10*△▲BCL-2 RNA 5.16±0.21 4.13±0.36*4.16±0.39*2.32±0.29*△▲

3.3 各組Tca8113細(xì)胞凋亡率水平比較 雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組Tca8113細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組Tca8113細(xì)胞凋亡率高于雷公藤紅素組、平陽霉素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；雷公藤紅素組、平陽霉素組Tca8113 細(xì)胞凋亡率相近（P＞0.05）。見表 3、插頁圖 2。

表3 各組Tca8113細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表3 各組Tca8113細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，△P＜0.05；與平陽霉素組比較，▲P＜0.05；聯(lián)合組：雷公藤紅素+平陽霉素

組別對(duì)照組雷公藤紅素組平陽霉素組聯(lián)合組孔數(shù)6 6 6 6凋亡率29.34±8.32 42.32±9.43*43.09±8.21*60.54±9.88*△▲

3.4 各組Tca8113細(xì)胞侵襲遷移能力的表達(dá) 對(duì)照組Tca8113穿膜數(shù)明顯高于雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組（P＜0.05）；雷公藤紅素組、平陽霉素組Tca8113細(xì)胞穿膜數(shù)明顯高于聯(lián)合組（P＜0.05）；雷公藤紅素組、平陽霉素組Tca8113細(xì)胞穿膜數(shù)相近（P＞0.05）。見表 4、插頁圖 3。

表4 各組Tca8113細(xì)胞穿膜數(shù)比較（個(gè)，±s）

表4 各組Tca8113細(xì)胞穿膜數(shù)比較（個(gè)，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，△P＜0.05；與平陽霉素組比較，▲P＜0.05；聯(lián)合組：雷公藤紅素+平陽霉素

組別對(duì)照組雷公藤紅素組平陽霉素組聯(lián)合組孔數(shù)6 6 6 6穿膜數(shù)757±19 434±25*458±54*223±33*△▲

3.5 各組Tca8113細(xì)胞MMP-9、cyc D1、VEGF表達(dá)水平比較 對(duì)照組MMP-9、cyc D1、VEGF表達(dá)水平明顯高于雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組（P＜0.05）；雷公藤紅素組、平陽霉素組 MMP-9、cyc D1、VEGF表達(dá)水平明顯高于聯(lián)合組（P＜0.05）；雷公藤紅素組、平陽霉素組MMP-9、cyc D1、VEGF表達(dá)水平相近（P＞0.05）。見表 5。

表5 各組Tca8113細(xì)胞MMP-9、cyc D1、VEGF表達(dá)水平比較（μmol/L，±s）

表5 各組Tca8113細(xì)胞MMP-9、cyc D1、VEGF表達(dá)水平比較（μmol/L，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，△P＜0.05；與平陽霉素組比較，▲P＜0.05；聯(lián)合組：雷公藤紅素+平陽霉素

組別對(duì)照組雷公藤紅素組平陽霉素組聯(lián)合組孔數(shù)6 6 6 6 MMP-9蛋白567.98±23.76 465.32±15.32*469.98±43.76*196.14±19.23*△▲cyc D1蛋白578.00±15.09 345.87±13.98*352.87±16.98*172.87±9.54*△▲VEGF蛋白916.91±28.97 630.87±14.87*625.87±15.76*245.76±32.76*△▲

3.6 各變量的相關(guān)性分析 miRNA-20a與BCL-2、MMP-9、cyc D1、VEGF 正相關(guān)關(guān)系明顯（P＜0.01）；BCL-2 與 MMP-9、cyc D1、VEGF 正相關(guān)關(guān)系明顯（P＜0.01）。見表 6。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-20a可通過抑制其凋亡來抑制Tca8113細(xì)胞的侵襲能力[15-16]。miRNA-20a通過上調(diào)Tca8113細(xì)胞中c-Met表達(dá)來促進(jìn)遷移和侵襲，與miR-17-92簇的其他成員相似，miR-20a在大多數(shù)癌細(xì)胞中作為具有高表達(dá)水平的致癌基因，例如非小細(xì)胞肺癌，前列腺癌，胃癌[17-18]。本研究結(jié)果顯示，雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組miRNA-20a、BCL-2 RNA 低于對(duì)照組（P＜0.05）；聯(lián)合組 miRNA-20a、BCL-2 RNA低于雷公藤紅素組、平陽霉素組（P＜0.05）；雷公藤紅素組 miRNA-20a、BCL-2 RNA 與平陽霉素組相近（P＞0.05）；說明雷公藤紅素聯(lián)合平陽霉素能明顯抑Tca8113細(xì)胞增殖，其機(jī)制與其通過抑制miRNA-20amRNA水平表達(dá)有關(guān)。本研究MTT測(cè)定結(jié)果顯示，雷公藤紅素聯(lián)合平陽霉素能誘導(dǎo)miR-20a在Tca8113細(xì)胞中低表達(dá)，進(jìn)而抑制Tca8113細(xì)胞的增殖。通過Annexin V-FITC凋亡實(shí)驗(yàn)，我們得出結(jié)論，miR-20a低表達(dá)可增加Tca8113細(xì)胞的凋亡。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，在雷公藤紅素聯(lián)合平陽霉素給藥情況下，Tca8113細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。國(guó)外研究表明，miR-20a在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中過表達(dá)，其水平與組織金屬蛋白酶-2密切正相關(guān)[19-20]。結(jié)合本研究結(jié)果，對(duì)照組MMP-9、cyc D1、VEGF表達(dá)水平明顯高于雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組；雷公藤紅素組、平陽霉素組MMP-9、cycD1、VEGF表達(dá)水平明顯高于聯(lián)合組；雷公藤紅素組、平陽霉素組MMP-9、cyc D1、VEGF 表達(dá)水平相近。這說明，雷公藤紅素聯(lián)合平陽霉素能抑制miRNA-20a及下游細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲。

表6 各變量的相關(guān)性分析

BCL-2負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和囊泡的細(xì)胞外分泌[21]，近期研究表明，BCL-2是原癌基因，能通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶RNA的編碼區(qū)特異性結(jié)合促進(jìn)RNA的翻譯，能促進(jìn)癌細(xì)胞錨定融合血管內(nèi)壁，擺脫免疫細(xì)胞的束縛，而一些血管活性因子（MCP-1、TNF-a、IL-1、IL-8）與 BCL-2 表達(dá)正相關(guān)[22]。BCL-2 是 miRNA-20a調(diào)控的下游基因，其能通過抑制BCL-2水平的表達(dá)而起到抑癌作用[23]。本研究結(jié)果中，雷公藤紅素組、平陽霉素組、聯(lián)合組BCL-2 RNA低于對(duì)照組；雷公藤紅素組BCL-2 RNA高于聯(lián)合組、平陽霉素組；雷公藤紅素組BCL-2 RNA與平陽霉素組相近（P＞0.05）；且 miRNA-20a 與 BCL-2、MMP-9、cyc D1、VEGF 正相關(guān)關(guān)系明顯；BCL-2 與 MMP-9、cyc D1、VEGF 正相關(guān)關(guān)系明顯，這說明，雷公藤紅素聯(lián)合平陽霉素能抑制BCL-2 RNA及下游細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲。

綜上所述，雷公藤紅素聯(lián)合平陽霉素能抑制miRNA-20a-BCL-2信號(hào)通路及下游細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲。