程 卉，李慶林，侯 梅，蘇婧婧

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，但卵巢上皮癌的病死率卻占各類婦科腫瘤的首位，對女性生命及生存質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅[1-3]?；瘜W(xué)治療是卵巢癌首選的治療方法之一，中藥及活性成分運(yùn)用于抗腫瘤治療具有悠久的歷史，且中藥以其藥源廣泛，不良反應(yīng)小，價格低廉，易于被患者接受等特點(diǎn)被用于化學(xué)治療的輔助治療。近年來，從中草藥中尋找天然抗腫瘤活性成分已經(jīng)成為抗癌藥物研究的一個重要途徑和研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以中藥藤黃的主要成分之一——新藤黃酸作為研究藥物，探討其對卵巢癌細(xì)胞株A2780的增殖抑制作用及其可能的作用機(jī)制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱：德國Memmert；生物安全柜(BSC-1600IIB2)：江蘇省蘇凈集團(tuán)；高壓蒸汽滅菌鍋(GI-36)：福建省廈門致微儀器有限公司；全自動多功能酶標(biāo)儀(Spectra-Max M2e)：美國MD公司；冷凍離心機(jī)：德國eppendorf；流式細(xì)胞儀(cytoflex)：美國Beckman cullter；倒置熒光顯微鏡(DMI-6000B)：德國徠卡公司。

1.2 試劑和藥品 新藤黃酸(純度>98%)：上海源葉生物有限公司；fluo-3AM：江蘇省碧云天生物有限公司；Hoechst 33342(貨號 B2261)：美國sigma公司；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法試劑盒：江蘇省南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Caspase-9(批號 16114)：美國Santa Cruz公司；細(xì)胞色素C(cytochrome C， Cyt C)(批號 AA43132)：美國Bioworld公司；p53蛋白(批號 GR194170-1)：英國Abcam公司。

2 方法

2.1 MTT檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞存活率的影響 消化對數(shù)生長期A2780，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，接種至96孔板中，每組對應(yīng)6個復(fù)孔，每組加入100 μL上述懸液。種板24 h后，每孔分別加入1、2、4、8、16、32 μmol/L的新藤黃酸溶液各100 μL，空白對照組加入相同容積的新鮮培養(yǎng)基。將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h。待細(xì)胞結(jié)束培養(yǎng)前4 h，用移液器吸棄舊的培養(yǎng)基，向各孔中加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μL，緩慢震搖15 min，充分混合。570 nm波長下，使用多功能酶標(biāo)儀檢測光密度(optical density，OD)，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3遍。按照下列公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%，然后以細(xì)胞存活率為縱軸，新藤黃酸濃度為橫軸，繪制細(xì)胞存活率曲線，計算IC50。

2.2 鈣離子水平檢測 將A2780細(xì)胞以每孔4×105接種于6孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日向各孔中加入2、4、8 μmol/L新藤黃酸，于培養(yǎng)箱中孵育24 h，用PBS輕柔洗滌細(xì)胞3次，加入1 μmol/L fluo-3AM染液至終濃度為0.05%，覆蓋細(xì)胞，置培養(yǎng)箱中孵育30 min，除去fluo-3AM染液， HBSS液洗滌細(xì)胞3次，加入HBSS液覆蓋細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，于倒置熒光顯微鏡下488 nm藍(lán)光激發(fā)拍照。

2.3 Hoechst 33342染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 胰酶消化收集的A2780細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為6×104/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔3 mL，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向各孔中加入2、4、8 μmol/L新藤黃酸溶液，平行設(shè)空白對照組，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。預(yù)冷的PBS緩沖液輕柔沖洗細(xì)胞2次，向各孔中加入2 mL多聚甲醛固定液固定20 min，預(yù)冷的PBS緩沖液輕柔沖洗細(xì)胞2次，各孔中加入1 mL含Hoechst 33342(終濃度為20 μg/mL)的PBS緩沖液，37 ℃避光孵育10 min，棄去染液，PBS沖洗，各孔加入1 mL PBS后于倒置熒光顯微鏡下采用紫外激發(fā)觀察并拍照。

2.4 新藤黃酸對A2780細(xì)胞周期的影響 將A2780細(xì)胞以每孔8×105接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日向各瓶中加入2、4、8 μmol/L新藤黃酸，于培養(yǎng)箱中孵育24 h，胰酶消化離心收集細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，棄去上清液。用-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇點(diǎn)動離心混勻固定細(xì)胞，避光放置于4 ℃冰箱24 h后，離心棄去上清，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，按說明書操作，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色10 min后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

2.5 新藤黃酸對A2780細(xì)胞凋亡率的影響 將卵巢癌細(xì)胞A2780細(xì)胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜后，各瓶中分別加入2、4、8 μmol/L新藤黃酸，培養(yǎng)箱中孵育24 h，采用不含EDTA的消化液消化，1 000 r/min離心5 min并收集細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，棄去上清液，各組分別加入400 μL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液，分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI溶液，混勻細(xì)胞，避光孵育15 min后，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。同時設(shè)陰性對照管和單標(biāo)補(bǔ)償調(diào)節(jié)管，采用FC500流式細(xì)胞儀自帶功能軟件進(jìn)行分析。

2.6 Western blot檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集后，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，再加入含PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液(強(qiáng))，置于冰上孵育10 min，12 000 r/min離心10 min收集上清于EP管中，加入上樣緩沖液后，100 ℃煮10 min，置于-20 ℃保存。蛋白定量后，每組上樣2.5 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，待電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入相應(yīng)的一抗(兔抗，稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)，置于搖床中4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，每次5 min，共3次；與對應(yīng)的二抗(山羊抗兔1∶10 000)室溫下孵育1 h后，TBST洗膜，每次5 min，共3次。化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒顯色，置于凝膠成像儀上拍攝。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 MTT檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞存活率的影響 本研究采用濃度分別為1、2、4、8、16、32 μmol/L新藤黃酸處理卵巢癌A2780細(xì)胞24、48 h后，MTT檢測結(jié)果可見，與對照組相比，各給藥組細(xì)胞存活率隨著新藤黃酸濃度的增高而降低，且呈現(xiàn)明顯的量效和時效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計算得出新藤黃酸作用A2780細(xì)胞24 h的IC50值為7.648 μmol/L，48 h的IC50值為6.426 μmol/L。見圖1。

圖1 新藤黃酸對A2780細(xì)胞存活率的影響

3.2 Fluo-3AM染色法觀察新藤黃酸對A2780細(xì)胞鈣離子水平的影響 Fluo-3AM染色熒光顯微鏡下觀察胞內(nèi)鈣離子的水平，結(jié)果顯示：空白對照組在視野下呈現(xiàn)均一而暗淡的綠色熒光，而新藤黃酸2 μmol/L組與空白對照組相比綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，新藤黃酸4 μmol/L和8 μmol/L組細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，且具有明顯的濃度依賴性。見圖2。

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L新藤黃酸組；C.4 μmol/L新藤黃酸組；D.8 μmol/L新藤黃酸組

圖2 Fluo-3AM染色法觀察新藤黃酸對A2780細(xì)胞鈣離子水平的影響(10×20倍)

3.3 Hoechst 33342檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞損傷的影響 Hoechst 33342染色倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組細(xì)胞在鏡下呈現(xiàn)均一且暗淡的藍(lán)色熒光，而新藤黃酸2、4、8 μmol/L組隨著藥物濃度的增加，藍(lán)色熒光的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明新藤黃酸可以誘導(dǎo)A2780細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。見圖3。

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L新藤黃酸組；C.4 μmol/L新藤黃酸組；D.8 μmol/L新藤黃酸組

圖3 Hoechst 33342染色觀察新藤黃酸對A2780細(xì)胞損傷的影響(10×20倍)

3.4 流式細(xì)胞儀檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞周期的影響 與正常對照組相比，新藤黃酸2、4、8 μmol/L組均表現(xiàn)出G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞比例顯著減少，且在2、4 μmol/L呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系,以上結(jié)果表明新藤黃酸能誘導(dǎo)A2780細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。見圖4。

3.5 流式細(xì)胞儀檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞凋亡率的影響 正常對照組細(xì)胞凋亡率在5%左右，細(xì)胞狀態(tài)良好，與正常對照組相比，新藤黃酸2、4、8 μmol/L組細(xì)胞凋亡率分別為(6.9±1.1)%、(13.4±3.7)%、(18.3±5.2)%，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)濃度依賴性升高，結(jié)果表明新藤黃酸能誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡。見圖5。

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L 新藤黃酸組；C.4 μmol/L新藤黃酸組；D.8 μmol/L新藤黃酸組

圖4 流式細(xì)胞儀檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞周期的影響

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L新藤黃酸組；C.4 μmol/L新藤黃酸組；D.8 μmol/L新藤黃酸組

圖5流式細(xì)胞儀檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞凋亡率的影響

3.6 Western blot檢測新藤黃酸對A2780細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步研究新藤黃酸誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度新藤黃酸作用細(xì)胞24 h后Cyt C、Caspase-9和p53蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新藤黃酸作用A2780細(xì)胞后隨著藥物濃度的增加，Cyt C、Caspase-9和p53蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性升高。見圖6。

注：與0 μmol/L新藤黃酸組比較，*P<0.05

圖6新藤黃酸對A2780細(xì)胞內(nèi)Cyt C、Caspase-9和p53蛋白表達(dá)的影響(Western blot法)

4 討論

藤黃是藤黃科植物藤黃的干燥樹脂，黃褐色且?guī)в邢灅庸鉂?，其具有攻毒蝕瘡、止血、殺蟲之功效，臨床用于頑癬濕瘡、無名腫毒、出血、燙傷以及腫瘤[4]。近年來，藤黃的主要成分新藤黃酸抗腫瘤活性日益受到科研工作者的關(guān)注，研究表明新藤黃酸對多種實(shí)體瘤細(xì)胞及白血病細(xì)胞均具有良好的抑制增殖作用，抗腫瘤活性強(qiáng)。本課題組多年研究結(jié)果表明，新藤黃酸作用多種腫瘤細(xì)胞株24 h的IC50為7.648 μmol/L,且對肺癌等裸鼠移植瘤具有良好的抑制腫瘤增長的效果[5-10]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測新藤黃酸對卵巢癌A2780細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果表明在1～32 μmol/L范圍內(nèi)新藤黃酸亦能有限降低A2780的存活率，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系，新藤黃酸作用24 h的IC50為7.648 μmol/L，表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性。

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生場所，細(xì)胞維持生命活動所需能量的95%均由線粒體提供，其對維持細(xì)胞的正常功能起著至關(guān)重要的作用[11]。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，研究發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)包含一些與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的物質(zhì)，如Cyt C、凋亡誘導(dǎo)因子、Ca2+和活性氧自由基[12-13]。研究表明，Cyt C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，各種凋亡刺激信號通過Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域3蛋白引起B(yǎng)cl-2相關(guān)蛋白X(Bcl-2-associated protein X,Bax)移位到線粒體外膜并多聚化，形成膜通道，線粒體的膜電位下降，膜通透性增加，刺激線粒體釋放Cyt C和第二線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑(second mitochondrial-derived activator of caspase, Smac)，當(dāng)Cyt C釋放到胞內(nèi)以后，與凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)相互作用，在ATP和dATP的協(xié)助下形成凋亡復(fù)合體，凋亡復(fù)合體通過招募并激活Caspase-9，其進(jìn)一步激活效應(yīng)Caspase-3和Caspase-7，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，切割細(xì)胞中多種底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)通過Annexin Ⅴ-FITC/PI試驗(yàn)觀察新藤黃酸誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新藤黃酸可以誘導(dǎo)A2780細(xì)胞發(fā)生凋亡；且Fluo-3AM染色結(jié)果顯示，隨著新藤黃酸藥物濃度的增加，胞內(nèi)Ca2+水平也逐漸升高；進(jìn)一步通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)新藤黃酸作用細(xì)胞后線粒體凋亡相關(guān)蛋白Cyt C、p53和Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著增加；此外，PI單染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，新藤黃酸能促使A2780細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，表明細(xì)胞增殖受到抑制。以上結(jié)果表明，新藤黃酸能誘導(dǎo)A2780細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡并且抑制細(xì)胞增殖，但其深入的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。