劉 偉,祁 雷,李慶寧 綜述 荊玨華 審校

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種死亡率高、致殘率高、醫(yī)療花費高的中樞神經(jīng)系統(tǒng) (central nervous system,CNS)疾病[1]，隨著現(xiàn)代社會經(jīng)濟和交通建筑事業(yè)的發(fā)展，其發(fā)病率逐年上升，我國每年新增病例超過6萬人，給患者家庭以及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，已經(jīng)引起醫(yī)師和學(xué)者的高度重視[2-3]。近 20 年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和人類基因組計劃的完成，臨床上發(fā)現(xiàn)了一類新的由內(nèi)源基因編碼的長度約為24 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子 (microRNA, miRNA)，它們在動植物體內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達調(diào)控[4]。研究[5]表明，miRNA在SCI后的病理生理發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。因此研究miRNA在SCI病理發(fā)展過程中的功能及作用，可以給SCI的診療與康復(fù)提供新的治療靶點和干預(yù)計策。

1 miRNA機制

1.1miRNA的形成機制miRNA是由20～24個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，其在表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達。它們最初從基因組DNA轉(zhuǎn)錄，主要是通過RNA聚合酶II以初級miRNA轉(zhuǎn)錄物的形式轉(zhuǎn)錄。初級miRNA長度可以是數(shù)千個堿基對，形成含有由反向重復(fù)組成的莖環(huán)的功能性二級結(jié)構(gòu)[6]，這些莖環(huán)被核糖核酸酶III識別和切割，導(dǎo)致從初級miRNA中釋放前體miRNA[7]。通過輸出蛋白5 (export protein 5, exportin-5)(參與核內(nèi)RNA輸出的蛋白質(zhì))，前體miRNA被從 細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，經(jīng)過一種核糖核酸內(nèi)切酶Dicer和一種RNA結(jié)合蛋白TAR 的RNA結(jié)合蛋白處理，形成成熟miRNA 和相似長度的互補鏈[8]，成熟的miRNA鏈一般具有生物活性，而互補鏈不具有生物活性，見圖1。

圖1 成熟miRNA的形成

1.2miRNA對SCI后的作用機制RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中包含Argonaute家族的蛋白質(zhì)在促進miRNA對mRNA的靶向和結(jié)合起到關(guān)鍵作用[9], 兩者結(jié)合后由于mRNA的穩(wěn)定性下降， miRNA-mRNA復(fù)合物的最終效果是降低蛋白質(zhì)產(chǎn)量，見圖2。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究[10]顯示，在生理條件下，單個miRNA可以下調(diào)數(shù)百種蛋白質(zhì)的表達，但是變化的幅度很小(<4倍)。此外，降低蛋白質(zhì)水平主要是由于mRNA不穩(wěn)定而不是抑制翻譯。這些發(fā)現(xiàn)表明，雖然特定的miRNA可能具有廣泛的作用，但是對在細胞中引起功能相關(guān)變化相對較小。靶向類似途徑基因的多個miRNA在細胞中引起功能相關(guān)的變化較大。miRNA靶向含有與miRNA'種子序列'互補的mRNA，miRNA種子序列是在miRNA的5'端包含2～7個核苷酸的區(qū)域，其在miRNA-mRNA結(jié)合中具有關(guān)鍵作用[11]。 mRNA上的miRNA結(jié)合位點通常在物種間保守，并且在3'非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)中發(fā)現(xiàn)。 特定的miRNA可以在同一mRNA中具有多個結(jié)合位點，由此增強其整體效果。 然而，并不是所有的mRNA都被miRNA靶向。估計只有1/3的mRNA含有miRNA結(jié)合位點[12]。一些缺乏miRNA結(jié)合位點的mRNA轉(zhuǎn)錄物含有短的3'UTR，因此缺少miRNA結(jié)合域。 這種轉(zhuǎn)錄物逃避miRNA介導(dǎo)的抑制，許多這些“短”mRNA調(diào)節(jié)細胞的關(guān)鍵功能(DNA修復(fù)，蛋白質(zhì)合成和增殖)。

1.3miRNA調(diào)控模式利用PicTar、MiRanda和TargetScan等生物信息學(xué)算法，可以預(yù)測miRNA的mRNA靶標(biāo)。如上所述，一個miRNA可以結(jié)合許多不同的mRNA，并且相同的mRNA可以被不同的miRNA結(jié)合。 因此，相同miRNA可以調(diào)節(jié)功能上相關(guān)的基因家族的許多成員，由此增強miRNA介導(dǎo)的抑制的整體效應(yīng)。 相反，同時上調(diào)靶向mRNA的多個miRNA，可以強烈抑制單個mRNA。 miRNAs能調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的各種模式，突出了這些分子的效能。

圖2 miRNA的作用機制

2 相關(guān)miRNA

盡管miRNA 在人類疾病中的功能與作用尚需要進一步闡明，但是越來越多的研究表明，miRNA 可以作為一種全新的藥物靶點。本部分重點闡述SCI研究領(lǐng)域的熱點 miRNA 及其可能的分子機制，見表1。

2.1miRNA-21相關(guān)文獻[13]報道了在人類許多不同的疾病(主要是癌癥)中miRNA-21異常的表達現(xiàn)象，并且發(fā)現(xiàn) miRNA-21表達上調(diào)與延長細胞存活、促進細胞生長、增殖以及減少細胞凋亡相關(guān)。研究[14]已證實miRNA-21的表達在許多CNS疾病如外傷性腦損傷(traumatic braininjury，TBI)中顯著上調(diào)，并且與TBI誘導(dǎo)的細胞凋亡和神經(jīng)元可塑性有關(guān)。Hu et al[3]通過miRNA-21拮抗劑抑制神經(jīng)元中的miRNA-21的表達，導(dǎo)致大鼠后肢運動功能恢復(fù)減弱，損傷部位范圍增大和正常組織范圍減少。與陰性對照組相比，用miRNA-21拮抗劑處理顯著增加了SCI后的細胞凋亡。促凋亡基因Fas配體(Fas ligand, FasL)、磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, PTEN)和程序性細胞死亡蛋白4(programmed cell death protein 4, PDCD4)被證明是miRNA-21在許多疾病和細胞類型中的直接靶點，使用miRNA-21拮抗劑可增加體內(nèi)FasL和PTEN的表達，但不影響PDCD4的表達。這些結(jié)果表明，miRNA-21在限制SCI后繼發(fā)性細胞死亡中發(fā)揮著重要作用，并且miRNA-21的保護作用可能是其對促凋亡基因的調(diào)節(jié)的結(jié)果[15]。

另一個動物模型中，SCI后5周，miRNA-21的表達也顯著增加，miRNA-21主要在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中表達[16-17]，提示miRNA-21在星形膠質(zhì)細胞中的作用可能是SCI后修復(fù)的關(guān)鍵點。Bhalala et al[16]在小鼠的星形膠質(zhì)細胞中通過轉(zhuǎn)基因過度表達了miRNA-21，結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細胞中miRNA-21的過度表達一方面降低了對SCI的肥大反應(yīng)。另一方面，星形膠質(zhì)細胞中miRNA-21的抑制可導(dǎo)致病變部位的軸突密度增加。

表1 相關(guān)miRNA的相關(guān)信息

這些發(fā)現(xiàn)共同證明了miRNA-21在SCI恢復(fù)中的新作用，這種 miRNA-21對細胞增殖和生長的影響因細胞類型而異。在星形膠質(zhì)細胞中有抑制作用，但在神經(jīng)元中有促進作用。因此為了最大化發(fā)揮miRNA-21的治療潛力，有必要對這些細胞特異性進行調(diào)節(jié)。

2.2miRNA-124CNS中特異性表達最為豐富的是miRNA-124。miR-124有3種亞型，其中以miRNA-124a最為常見。miRNA-124在急性脊椎外傷所致急性SCI中可能具有確診價值。陳聚伍 等[18]研究發(fā)現(xiàn)脊髓完全損傷組、脊髓不完全損傷組患者外傷后24 h內(nèi)的外周靜脈血的 miRNA-124、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平都高于神經(jīng)功能正常組，表明以上兩項指標(biāo)對于脊椎外傷患者的急性 SCI的確診均有指導(dǎo)意義，其中miRNA-124診斷急性 SCI的特異度(90%)和靈敏度(90%)均高于TNF-α的特異度80%和靈敏度76.7%。所以有望將miRNA-124作為確診脊椎外傷后急性SCI 的潛在檢測標(biāo)志物。 Song et al[19]在 SCI大鼠模型中研究了miR-124修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)移植修復(fù)大鼠 SCI的機制。研究[19]發(fā)現(xiàn)，miR-124加速了 BMSCs向神經(jīng)細胞的分化，促進了 SCI的修復(fù)。miRNA-124的過度表達抑制吡哆醛激酶(pyridoxal kinase，PDXK)的表達，這可能是miRNA-124如何促進 BMSCs分化的一個可能的機制，這項發(fā)現(xiàn)可能為 SCI治療提供了一個新的目標(biāo)。

2.3miRNA-133-bmiRNA-133-b通過降低ras同源蛋白A (ras homology protein A, RhoA)的表達來作為成年斑馬魚脊髓再生的重要決定因素[20]。Conrad et al[21]發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚的SCI模型在脊髓橫斷后的再生腦干神經(jīng)元中的miRNA-133-b表達被極度上調(diào)，反義嗎啉代誘導(dǎo)的miRNA-133-b表達下調(diào)導(dǎo)致運動恢復(fù)減弱并軸突再生減少。miRNA-133-b靶向調(diào)節(jié) RhoA，其表達在SCI后顯著上調(diào)，而 RhoA的抑制促進了皮質(zhì)脊髓束的修復(fù)，并通過減少 SCI后組織損傷來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[22]。這些研究使得miRNA-133-b和RhoA成為在SCI中具有吸引力的治療靶點。

2.4miRNA-486與miR-21相類似，在鼠挫傷模型中SCI后第7天，同樣檢測到miRNA-486表達的增加。Jee et al[23]研究已經(jīng)證明，將miRNA-486輸注到健康小鼠的脊髓中會降低運動功能并增加神經(jīng)元死亡。 相反，在小鼠SCI模型中敲除miRNA-486可以改善后肢功能恢復(fù)[24]。 運動神經(jīng)元中miRNA-486的主要靶點是神經(jīng)原性分化6 (neurogenic differentiation 6, NeuroD6)，它是神經(jīng)元分化和氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要蛋白質(zhì)[25]。 NeuroD6誘導(dǎo)SCI后谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPx3)和硫氧還蛋白樣1(thioredoxin-like 1，TXNL1)的表達，可以有效清除 SCI中過度活性氧(reactive oxygen species, ROS)并減輕炎癥[24]。基于這些發(fā)現(xiàn)，有希望的SCI治療策略是可以通過上調(diào)NeuroD6表達來抑制miRNA-486，從而達到降低細胞凋亡并改善SCI后的功能缺陷的目的。

2.5miRNA-219和miRNA-338由脊髓CNS中的少突膠質(zhì)細胞(oligodendrocytes，OLs)形成的髓鞘使軸突絕緣，從而加快動作電位傳播。OLs損傷后髓鞘修復(fù)失敗使衰弱性疾病中的脫髓鞘持續(xù)存在，如多發(fā)性硬化和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良[26]。miRNA-219和miRNA-338在成熟OLs中優(yōu)先和大量表達[27-30]，兩種miRNA在從脊椎動物到人類的基因組進化中相對保守。Wang et al[31]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-219缺陷不影響少突膠質(zhì)前體細胞(oligodendrocytes precursor，OPC)形成，但是在發(fā)育過程中抑制它們的分化，miRNA-338對于CNS中的正常 OLs髓鞘形成不是必要的，但是miRNA-219在髓鞘形成中與miRNA-338協(xié)同能促進CNS 中的髓鞘修復(fù)。

3 總結(jié)與展望

到目前為止，已能證實單一 miRNA能夠調(diào)節(jié)SCI后的關(guān)鍵過程，例如調(diào)控細胞炎癥、死亡和凋亡。這些結(jié)果表明miRNA可以參與調(diào)控SCI后的繼發(fā)損傷，促進損傷后的再生過程，從而有助于減輕SCI后的功能障礙。然而，CNS損傷后發(fā)生的細胞和分子變化是多種多樣的，這就使單靶點治療的療效大大降低。由于眾多miRNA可通過多種機制作用于靶RNA，參與SCI疾病的預(yù)后，因此針對各種途徑中的多種miRNA組合進行相關(guān)研究是必要的。開發(fā)基于miRNA治療是實現(xiàn)這一目標(biāo)的有吸引力的手段。這篇綜述討論了SCI后miRNA的變化以及這些變化的生理和病理效應(yīng)。然而，目前對SCI發(fā)病機制的了解仍然有限，需要做更多的研究來探索SCI相關(guān)miRNA的功能和靶點。