王 喆，鄒微微，章志國(guó)，紀(jì)冬梅，曹云霞

在輔助生殖過(guò)程中，影響妊娠結(jié)局的一個(gè)重要步驟是胚胎移植技術(shù)。隨著囊胚培養(yǎng)以及囊胚玻璃化凍融技術(shù)在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，目前新鮮周期移植取消率增加，全胚胎冷凍后的凍融胚胎移植比例明顯增長(zhǎng)[1]。已有研究[2]表明，全胚胎冷凍可以使卵巢過(guò)度刺激綜合征高風(fēng)險(xiǎn)、內(nèi)膜異常、孕激素過(guò)高及患有全身性疾病等不適合新鮮移植的患者將胚胎冷凍以后再移植。有研究[3]表明凍融胚胎移植后的臨床妊娠結(jié)局相比于新鮮周期移植的妊娠結(jié)局更好?；颊咦陨?xiàng)l件、胚胎發(fā)育天數(shù)與質(zhì)量及移植技術(shù)等多方面因素是決定凍融囊胚是否可獲得臨床妊娠的關(guān)鍵因素。Kovalevsky et al[4]的研究認(rèn)為第5日(D5)囊胚凍融移植后臨床妊娠率、種植率和抱嬰率顯著高于第6日(D6)凍融囊胚，但Hiraoka et al[5]研究表明D5和D6囊胚凍融移植的臨床結(jié)局并無(wú)明顯差異。胚胎移植技術(shù)中包含很多影響因素，包括移植管類型、移植管血染程度、胚胎裝載入移植管的方式等均會(huì)影響妊娠結(jié)局。所以輔助生殖助孕中的凍融囊胚移植需要大樣本統(tǒng)計(jì)分析并建立標(biāo)準(zhǔn)化操作流程來(lái)最大程度的幫助患者提高臨床妊娠結(jié)局。本研究回顧性的分析了行體外受精(invitrofertilisation,IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治療后首次解凍移植的患者共1 032例，比較Cook移植管與Wallace移植管、D5凍融囊胚與D6凍融囊胚對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2016年8月～2017年8月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心首次接受凍融囊胚移植助孕治療的不孕癥患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 年齡<40歲；② 首次進(jìn)行解凍移植的D5或D6囊胚；③ 不孕原因?yàn)榕枨惠斅压芤蛩鼗蚰蟹揭蛩?；排除?biāo)準(zhǔn)：① 遺傳性及家族性病史；② 有習(xí)慣性流產(chǎn)史、不良妊娠史；③ 子宮生殖道畸形；④ 疤痕子宮(剖宮產(chǎn)、子宮肌瘤挖除史)；⑤ 卵巢功能減退、子宮內(nèi)膜異位癥。本研究為病例對(duì)照研究，獲得安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2囊胚培養(yǎng)患者采用的促排卵方案包括長(zhǎng)方案、短方案、拮抗劑方案、微刺激方案等。絨毛膜促性腺激素(hCG)注射后34～36 h取卵，所獲卵母細(xì)胞置于受精培養(yǎng)液中，男方手淫法或穿刺法取精，精液采用梯度離心法或上游法處理。取卵后3 h行體外受精或者卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射。授精后4～6 h拆除顆粒細(xì)胞觀察是否排出第二極體，再將受精卵移至卵裂期培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。授精后16～20 h觀察原核形成情況，挑出多PN受精及受精異常胚胎，其余繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察第3日胚胎，評(píng)估卵裂期胚胎質(zhì)量，后將胚胎移入囊胚期培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至D5或D6囊胚。采用Gardner囊胚評(píng)分法對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分，將D5評(píng)分≥3AA、3AB、3BA、3BB或者D6評(píng)分≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚定為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.3囊胚的玻璃化冷凍-解凍囊胚冷凍流程：① 采用Hamilton軟件進(jìn)行激光打孔，打孔時(shí)避開囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；② 打孔后囊液流出約5 min后囊胚皺縮；③ 室溫下，將囊胚移入平衡液中5 min；④ 囊胚轉(zhuǎn)移至玻璃化冷凍液中不超過(guò)60 s；⑤ 將囊胚放至在已標(biāo)記的冷凍載桿上并迅速浸入液氮中保存。囊胚解凍流程：① 將冷凍載桿浸入解凍液中不超過(guò)60 s；② 迅速將胚胎移至稀釋液和洗滌液1、2中各3 min；③ 最后將胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中，并置于平板培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)；④ 復(fù)蘇2 h后觀察囊胚的存活情況。

1.4囊胚移植本中心凍融周期首次解凍移植優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.4.1移植前子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備 囊胚移植的內(nèi)膜準(zhǔn)備分為自然周期和人工周期。采用自然周期的患者通過(guò)經(jīng)陰道超聲監(jiān)測(cè)卵泡大小、內(nèi)膜厚度和形態(tài)，通常于排卵日開始口服地屈孕酮(10 mg、Bid)，排卵后D5解凍移植D5或D6囊胚。采用人工周期的患者自月經(jīng)第3日起口服戊酸雌二醇，12日后經(jīng)陰道超聲監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度，醫(yī)師可根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整用藥劑量，待內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，黃體酮60 mg/d肌注，5 d后解凍D5或D6囊胚并移植。

1.4.2移植管選擇 Cook組采用美國(guó)Cook移植管(型號(hào)：K-JETS-551910-s)，由導(dǎo)引導(dǎo)管和轉(zhuǎn)移導(dǎo)管組成：導(dǎo)引導(dǎo)管長(zhǎng)17.3 cm，直徑約1.81 mm，白色，頭部成球頸型，頭端預(yù)彎有25°傾角，宮頸塞設(shè)在離頭端4 cm處，在離頭端5 cm處另設(shè)有一個(gè)活塞；移植導(dǎo)管長(zhǎng)24 cm，后端有金屬支撐管支撐，前端為8 cm長(zhǎng)的聚乙烯管，外徑約0.93 mm，內(nèi)徑約0.47 mm，底部有間隔1 cm的4個(gè)刻度。在導(dǎo)引導(dǎo)管進(jìn)入宮腔困難時(shí)，可加用支撐芯輔助導(dǎo)引導(dǎo)管穿越宮頸。Wallace組采用英國(guó)Wallace移植管(型號(hào)：1816)，長(zhǎng)18 cm，由兩部分組成：外導(dǎo)管為聚丙烯管，直徑約2.24 mm，外導(dǎo)管內(nèi)常規(guī)含有內(nèi)芯，內(nèi)導(dǎo)管為聚氨酯管，直徑約1.65 mm。

1.4.3凍融囊胚移植方法 在實(shí)施胚胎移植前囑患者憋尿，取截石位。行經(jīng)腹部B超確定子宮位置、宮體與宮頸的角度、宮頸管長(zhǎng)度及宮腔深度。插導(dǎo)引導(dǎo)管前去除宮頸粘液，用含囊胚培養(yǎng)液的棉簽清洗宮頸內(nèi)口。兩組裝載胚胎的方法相同，待移植醫(yī)師提示可以裝載胚胎時(shí)開始裝載，移植管末端連接1 ml注射器，用囊胚培養(yǎng)液沖洗移植管，先抽吸約1 cm空氣，其次是約2 cm含胚移植液，最后是約1 cm空氣。裝載完畢后將移植管遞給助手輔助醫(yī)師進(jìn)行移植。Cook組移植流程：手術(shù)醫(yī)師將導(dǎo)引導(dǎo)管由宮頸內(nèi)口進(jìn)入宮腔，如果由宮頸口進(jìn)入宮腔困難，可在導(dǎo)引導(dǎo)管內(nèi)插入支撐芯輔助穿越宮頸，然后將支撐芯抽出，由助手協(xié)助將裝載胚胎的轉(zhuǎn)移導(dǎo)管插入宮腔，緩慢推注完全后留管40 s，取出轉(zhuǎn)移導(dǎo)管及導(dǎo)引導(dǎo)管，送培養(yǎng)室檢查有無(wú)胚胎殘留。Wallace組移植流程：將外導(dǎo)管由宮頸內(nèi)口輕插入宮腔，插入外導(dǎo)管成功后，抽出內(nèi)芯，由助手協(xié)助插入裝載有胚胎的內(nèi)導(dǎo)管，將胚胎緩慢注入宮腔后，留管40 s，將移植內(nèi)、外管一起抽出，送培養(yǎng)室檢查有無(wú)胚胎殘留。

表1 Cook組與Wallace組的一般資料比較

1.5胚胎移植后處理及妊娠結(jié)局判斷患者平臥休息40 min后離院，醫(yī)生指導(dǎo)下繼續(xù)予以黃體支持治療。生化妊娠：移植后14 d測(cè)血hCG陽(yáng)性；臨床妊娠：移植后30 d行陰道B超檢查宮腔內(nèi)孕囊數(shù)目及有無(wú)心管搏動(dòng)。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%；胚胎種植率=B超下檢測(cè)到孕囊數(shù)/移植囊胚數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；單卵雙胎率=單卵雙胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1患者基本情況分析共有1 032個(gè)周期符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)，Cook組共627個(gè)周期，其中D5組472個(gè)周期，D6組155個(gè)周期；Wallace組共405個(gè)周期，其中D5組304個(gè)周期，D6組101個(gè)周期。各組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)值、基礎(chǔ)黃體生成素(LH)值、基礎(chǔ)雌二醇(E2)等一般情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組間有可比性。見表1。

2.2不同移植管對(duì)妊娠結(jié)局的影響Cook組與Wallace組、Cook-D5組與Wallace-D5組、Cook-D6組與Wallace-D6組各組間的獲卵數(shù)、受精數(shù)、2PN數(shù)、囊胚形成率、移植胚胎數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Cook組的生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率均高于Wallace組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者的異位妊娠率與單卵雙胎率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2；在同樣移植D5凍融囊胚的情況下，Cook-D5組的生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率均高于Wallace-D5組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Cook-D5組(2.24%)的單卵雙胎率雖明顯高于Wallace-D5組(0.49%)，但單卵雙胎率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3；在同樣移植D6凍融囊胚的情況下，Cook-D6組與Wallace-D6組的生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

2.3D5凍融囊胚和D6凍融囊胚的實(shí)驗(yàn)室及妊娠結(jié)局比較無(wú)論使用Cook移植管或者Wallace移植管，Cook-D5組、Wallace-D5組的獲卵數(shù)、受精數(shù)、2PN數(shù)、囊胚形成率、生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率均分別高于Cook-D6組、Wallace-D6組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5、表6。

表2 Cook組與Wallace組的囊胚形成與妊娠結(jié)局比較

表3 Cook-D5組與Wallace-D5組的囊胚形成與妊娠結(jié)局比較

表4 Cook-D6組與Wallace-D6組的囊胚形成與妊娠結(jié)局比較

3 討論

近年來(lái)研究表明凍融移植周期在輔助生殖技術(shù)中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，可獲得與新鮮移植周期相當(dāng)甚至更好的妊娠結(jié)局。在凍融移植周期中，內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、子宮內(nèi)膜厚度、胚胎發(fā)育天數(shù)及質(zhì)量、胚胎移植管的選擇、胚胎裝載技術(shù)、是否使用超聲引導(dǎo)、移植難易程度、不同醫(yī)師的熟練程度等多種因素均會(huì)影響胚胎是否移植成功。關(guān)于移植管是否會(huì)影響妊娠結(jié)局目前尚無(wú)定論[6-7]。有研究[8]表明D5新鮮囊胚移植的妊娠率和種植率高于D6新鮮囊胚移植, 但凍融囊胚移植周期中由于冷凍及復(fù)蘇的影響，不同發(fā)育天數(shù)囊胚移植的選擇目前仍存在爭(zhēng)議。因此在凍融囊胚移植周期中，移植管的選擇和囊胚發(fā)育天數(shù)的選擇是目前臨床上急待需要解決的問(wèn)題。

表5 Cook-D5組與Cook-D6組的囊胚形成與妊娠結(jié)局比較

表6 Wallace-D5組與Wallace-D6組的囊胚形成與妊娠結(jié)局比較

3.1胚胎移植管的選擇目前臨床上的胚胎移植管主要分為軟移植管和硬移植管，而已有較多研究證實(shí)軟移植管比硬移植管的妊娠結(jié)局更優(yōu)。但是不同軟管間哪種移植管更好，目前的研究大部分為小樣本對(duì)新鮮胚胎的研究，且并無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。Cook移植管和Wallace移植管是目前生殖中心最常使用的兩種移植管，而關(guān)于哪種移植管更好目前尚無(wú)統(tǒng)一意見。Saldeen et al[9]的一項(xiàng)前瞻性研究比較202名患者使用Cook Sydney IVF(K-JETS-7019-SIVF)移植管與198名患者使用Edward-Wallace移植管，發(fā)現(xiàn)兩者的臨床妊娠率與活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Rhodes et al[10]研究表明Cook World移植管相比Edward-Wallace移植管，臨床妊娠率高5%，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究共納入1 032例解凍移植周期，比較兩種軟移植管對(duì)妊娠結(jié)局的影響。兩組患者在平均年齡、基礎(chǔ)性激素、取卵周期獲卵數(shù)、受精數(shù)、2PN數(shù)、囊胚形成率、移植胚胎評(píng)價(jià)和內(nèi)膜厚度等基本參數(shù)上具有可比性，分析了移植管這一因素對(duì)妊娠結(jié)局的影響，結(jié)果表明Cook移植管可將首次凍融周期的臨床妊娠率與胚胎種植率提高將近7%，尤其對(duì)于移植D5凍融囊胚Cook移植管相比于Wallace移植管的優(yōu)勢(shì)更顯著，臨床妊娠率提高將近8%，可以顯著改善妊娠結(jié)局，而移植D6凍融囊胚雖Cook移植管妊娠結(jié)局更好，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果對(duì)臨床有指導(dǎo)意義。Cook移植管獲得了較好的臨床結(jié)局可能和以下因素有關(guān)：一是為了方便手術(shù)醫(yī)師更準(zhǔn)確快速的將移植管置管入宮腔，Cook移植管在設(shè)計(jì)時(shí)考慮到女性宮體與宮頸的生理彎曲度，將導(dǎo)引導(dǎo)管前端預(yù)先保留25°傾角；宮頸塞的刻度設(shè)在離頭端4 cm處且前端頭部圓鈍，確保導(dǎo)引導(dǎo)管進(jìn)入宮頸內(nèi)口后立即停止，盡可能減少導(dǎo)引導(dǎo)管進(jìn)入宮腔的深度，避免導(dǎo)引導(dǎo)管對(duì)宮腔的損傷。二是移植導(dǎo)管內(nèi)徑更細(xì)，僅為1.4Fr(約0.47 mm),且柔軟，可避免造成宮內(nèi)出血以及內(nèi)膜損傷，但同時(shí)是否因內(nèi)徑過(guò)細(xì)造成單卵雙胎率增加仍需增大樣本量進(jìn)一步探究；裝載胚胎的液體量有可能影響妊娠結(jié)局，在裝載胚胎時(shí)管徑越細(xì)，所需的含胚液體量越少，雖同樣裝載約2 cm含胚液體，Cook移植導(dǎo)管所用的液體量較Wallace內(nèi)管少，且Wallace移植管沒有刻度，無(wú)法精確把握移植管的空氣與液體量；三是Cook導(dǎo)引導(dǎo)管無(wú)內(nèi)芯，相對(duì)于有內(nèi)芯的Wallace導(dǎo)管更加柔軟，且置管后不用拔出內(nèi)芯可避免對(duì)宮腔產(chǎn)生抽吸作用導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷。四是相對(duì)于Wallace移植管內(nèi)管與外管之間空隙較大，Cook導(dǎo)引導(dǎo)管與移植導(dǎo)管之間貼合更為緊密，降低了胚胎滯留于移植管內(nèi)的概率。而移植D6囊胚Cook移植管相比Wallace移植管優(yōu)勢(shì)不明顯，其原因可能是：D6囊胚較D5囊胚囊胚腔擴(kuò)張更大且可能已孵出，在凍融過(guò)程中對(duì)胚胎質(zhì)量影響更大；Wallace移植管較Cook移植管管徑大，若囊胚已孵出，則在囊胚被裝入移植管的過(guò)程中，孵出囊胚在管徑較大的移植管內(nèi)其形態(tài)保持更完好，受到的摩擦力更小，其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)所受的影響也越小。

3.2凍融移植囊胚的選擇已有研究[11]表明囊胚發(fā)育天數(shù)、凍融囊胚質(zhì)量以及移植數(shù)目顯著影響凍融囊胚的妊娠結(jié)局。譚巧 等[12]回顧性的分析了1 539例D5與D6凍融囊胚移植妊娠結(jié)局, 結(jié)果顯示對(duì)于35周歲以下的女性，移植D5或者D6優(yōu)質(zhì)囊胚其臨床妊娠結(jié)局無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在無(wú)優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植情況下，移植D5非優(yōu)質(zhì)凍融囊胚可獲得較好的妊娠結(jié)局。本研究結(jié)果顯示，D5凍融囊胚組獲卵數(shù)、2PN數(shù)、受精數(shù)、囊胚形成率、生化妊娠率、臨床妊娠率和胚胎種植率均高于D6凍融囊胚組。可能原因如下：D6囊胚較D5囊胚囊胚腔擴(kuò)張更大，行玻璃化冷凍操作后可能對(duì)囊胚質(zhì)量影響更大；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)液的改變可能導(dǎo)致胚胎質(zhì)量變差；D6囊胚發(fā)育較D5囊胚相對(duì)遲緩，D5囊胚較D6囊胚DNA損傷可能更少；還有研究[13]顯示胞質(zhì)內(nèi)線粒體含量明顯影響胚胎發(fā)育潛能，D5囊胚線粒體含量可能高于D6；D6凍融囊胚移植與子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備不同步也可能影響妊娠結(jié)局。

綜上所述，在移植D5優(yōu)質(zhì)凍融囊胚時(shí)，優(yōu)先選擇Cook-K-JETS-551910-S移植管較Wallace-1816移植管進(jìn)行移植可獲得更好的臨床妊娠率和胚胎種植率；在D5與D6同是優(yōu)質(zhì)囊胚的情況下，優(yōu)先選擇D5囊胚進(jìn)行移植可獲得更好的臨床妊娠率與胚胎種植率。胚胎移植過(guò)程中選擇適合患者的移植管可直接影響手術(shù)操作及妊娠結(jié)局。應(yīng)盡量選擇軟質(zhì)、管徑較細(xì)、符合生理構(gòu)造、順滑和對(duì)子宮內(nèi)膜損傷最小的胚胎移植管，以減少困難移植發(fā)生率，減輕患者焦慮情緒，提高臨床妊娠結(jié)局。本研究為回顧性數(shù)據(jù)分析，僅納入了本中心常使用的兩種類型移植管，對(duì)于應(yīng)該選擇何種移植管以期獲得最大的臨床妊娠率，仍需要進(jìn)行多中心的、納入更多移植管類型的前瞻性研究。