蔣晟昰，吳 育，石美琴，蔡 艷，繆 婧，楊水英

南通市中醫(yī)院藥劑科，南通226001

肝細胞癌（HCC）被公認為是世界范圍內(nèi)最普遍和最具侵襲性的原發(fā)性惡性腫瘤[1]。雖然隨著基因組學(xué)的不斷發(fā)展，人們對HCC發(fā)病進展的認知有了一定的了解。盡管當前針對HCC的治療取得了不錯的進展，但是由于HCC的侵襲性是基于腫瘤細胞的高度轉(zhuǎn)移潛性，目前仍然無法提供有效靶向治療。惡性腫瘤易轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，肝癌細胞是否擴散至淋巴結(jié)往往是評價肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的首要指標，也是作為一個重要的預(yù)后評價指標[2]。HCC最大的危害在于其癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，隨著病程的發(fā)展，癌細胞可以從原發(fā)瘤固定部位轉(zhuǎn)移侵襲至人體另一個軟組織器官上。

前人研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)中檢測到肌動蛋白2（actin gamma 2，ACTG2）表達水平[3]。而在幾種不同的癌癥中均已發(fā)現(xiàn)ACTG2的異常表達。與結(jié)腸癌相比，在正常結(jié)腸組織中ACTG2具有較低表達水平。ACTG2的高表達與惡性疾病有關(guān)的這些發(fā)現(xiàn)突出了ACTG2在治療腫瘤進展中的重要作用；然而，ACTG2促進HCC侵襲轉(zhuǎn)移的機制仍然很不清楚。故本研究探討ACTG2在肝癌細胞的轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材 料

肝癌細胞HepG2、Bel-7404、Bel-7402、SMMC-7721和正常肝細胞LO2細胞均獲自中科院細胞培養(yǎng)中心（CBTCCCAS，上海）；逆轉(zhuǎn)錄病毒pDisrup（Lipofectamine RNAiMAX，批號13778030，Thermo Scientific公司）；無胸腺裸鼠BALB/c（許可證號2008001641729，上海實驗動物研究中心），飼養(yǎng)于南通大學(xué)實驗動物中心；青霉素G鈉鹽（批號2013242）、硫酸鏈霉素（批號2012382）均購自Amresco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號G111A 22258402，Promega公司）；Transwell板（8μm，Corning公司）；化學(xué)發(fā)光試劑 （批號HK108231、IA110436，Pierce公司）。電泳儀（型號DYY-C，Bio-Rad公司）；FCE凝膠成像儀、DG5036酶聯(lián)免疫檢測儀（深圳市三利化學(xué)品公司）；SynergyTMHT多微孔板讀數(shù)器（美國Bio-Tek公司）。

2 實驗方法

2.1 MTT法測定

以MTT法測定癌細胞SMMC-7721增殖活力。將該細胞接種至96孔板中，每孔200μL，約1 000個細胞/孔。將96孔板置37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)12 h和24 h，使細胞貼壁。向每孔中加入20μL的試劑，繼續(xù)孵育4 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測定吸光度值。用SynergyTMHT多微孔板讀數(shù)器讀數(shù)、計數(shù)[4]。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒p Disrup和特異性靶基因ACTG2的shRNA構(gòu)建體

基于MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX作為骨架構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒pDisrup。根據(jù)晚期人體腺病毒2型mRNA內(nèi)含子序列設(shè)計剪接供體和受體。含25μg·mL-1HCl的殺稻瘟菌素（Blasticidin S，Invitrogen，USA）對用于篩選pDisrup穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。針對特異性靶基因ACTG2的shRNA成功構(gòu)建（Santa Cruz Biotechnology，USA）。 使 用Lipofectamine RNAi MAX試劑（Invitrogen）進行瞬時轉(zhuǎn)染，并遵循制造商的說明書。

2.3 3′-RACE實驗

以3′cDNA末端快速擴增技術(shù)（3′-RACE）擴增與HCC內(nèi)源性基因部分融合的neo基因。分離總RNA，用引物5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGA GCTCAAGC-3′進行逆轉(zhuǎn)錄。將所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用以下引物進行巢式PCR：p1/q1（5′-ATGGGCTGACCGCT TCCT-3′和5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3'）和p2/q2（5′-GACGAGTTCTTCTGACTAGCT AG-3′和5′-GAGGACTCGAGC TCAAGC-3′）。p1和p2位于neo抗性基因上，而q1和q2位于QT的特定序列上。將PCR片段亞克隆到TA克隆載體（Invitrogen）中行DNA測序[5]。

2.4 Western Blot測定ACTG2

用PBS洗滌ACTG2mut和野生型HepG2細胞兩次后，以冷裂解液萃取細胞，4℃、15 000 r·min-1離心10 min。配制10%分離膠和4%濃縮膠，蛋白上樣量為30μg，電泳結(jié)束樣品轉(zhuǎn)移至PVDF。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜放入雜交袋中與不同的特異性ACTG2一抗孵育。用PBS洗滌30 min后，將膜再與相應(yīng)的辣根過氧化物酶的山羊抗兔二抗反應(yīng)孵育，并與化學(xué)發(fā)光底物（PIERCE）反應(yīng)。設(shè)置內(nèi)參蛋白為GAPDH，采用Western Blot方法檢測蛋白。

2.5 劃痕實驗檢測ACTG2mut、野生型Hep G2和SMMC-7721遷移能力

將ACTG2mut、野生型HepG2和SMMC-7721細胞接種在60 mm的培養(yǎng)皿中并在37℃下培養(yǎng)過夜，當細胞長到融合成單層狀態(tài)時，于無血清培養(yǎng)基中饑餓24h后，在融合的單層細胞上刮傷單層產(chǎn)生傷口，制造一個空白區(qū)域，在劃傷后0h和24 h拍攝無細胞劃痕面積。通過測量剩余無細胞面積與初始傷口面積的百分比來確定傷口愈合效果[6]。

2.6 集落形成評估SMMC-7721細胞增殖能力

將細胞以每皿含500個細胞的濃度接種于培養(yǎng)皿（直徑60 mm）中，平行操作3次。3周生長后，將細胞固定并用0.1%結(jié)晶紫染色，計數(shù)可見菌落。所有實驗重復(fù)至少3次。

2.7 Transwell實驗測定ACTG2mut、野生型HepG2、SMMC-7721細胞侵襲能力

將含有1×105個細胞的500μL無血清培養(yǎng)基加入上室，并將750μL培養(yǎng)基加入下腔。在加濕培養(yǎng)箱中孵育6 h后，用棉簽拭子擦洗去除膜上表面的非侵入性細胞，并將遷移到膜下表面的侵入性細胞固定并用0.1%結(jié)晶紫染色，然后通過顯微鏡拍攝膜并進行細胞計數(shù)。

2.8 免疫細胞化學(xué)檢測細胞ACTG2干擾效果

在玻璃蓋玻片上的細胞用預(yù)冷的丙酮固定，然后用PBS漂洗3次。將細胞在0.1%Triton X-100中透化，并與1%BSA/PBS孵育以阻斷非特異性結(jié)合。隨后，與兔單克隆抗體孵育來阻斷ACTG2。用PBS洗滌后，將細胞與標記了辣根過氧化物酶的二抗反育山羊抗兔二抗（1∶60稀釋，Boster Biotechnology）孵育。細胞核用DAPI進行復(fù)染。

2.9 體內(nèi)實驗性轉(zhuǎn)移模型測定腫瘤轉(zhuǎn)移

將24只無胸腺裸鼠BALB/c隨機分4組。于裸鼠尾靜脈注射5×105個細胞，其中HepG2細胞為對照組，余3組分別為穩(wěn)定表達ACTG2的細胞組（ACTG2-OE組）、轉(zhuǎn)染ACTG2 shRNA質(zhì)粒的SMMC-7721組、Scramble陰性對照組。在接種2周后處死，并檢查所有器官是否有肉眼可見的腫瘤轉(zhuǎn)移。于HE染色解剖顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。

2.10 定量實時PCR

使用RNEasy試劑盒（Qiagen）提取總RNA。使用QuantiTect Reverse Transcription試劑盒（Qiagen）對1μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用于PCR的引物如下（分別為正義和反義）：GAPDH：正向：5′-CTCACCGGATGCACCAATGTT-3′， 反 向 5′-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3′；ACTG2：正向：5′-GCGTGTAGCACCTGAAGAG-3′，反向5′-GAATGGCGACGTACATGGCA-3′；在ABI Prism 7500熱循環(huán)儀上用MESA GREEN qPCR MasterMix（Eurogentec）進行PCR擴增。用RT2 Profiler PCR EMT Array（Qiagen）進行基因篩選。

2.11 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差（x±s）表示。使用T檢驗或單因素方差A(yù)NOVA分析，以事后Dunnett檢驗來評估兩組結(jié)果的差異性。*P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 ACTG2對HCC侵襲與轉(zhuǎn)移起著調(diào)節(jié)作用

為了闡明參與HCC細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，將pDisrup載體轉(zhuǎn)染到肝癌HepG2細胞中，并通過Blasticidin S篩選HepG2突變細胞，沉默ACTG2。通過劃痕試驗證明所選擇的突變型HepG2細胞的遷移潛能。采用3′-RACE擴增具有增加或降低遷移潛力的細胞，分析與HCC細胞轉(zhuǎn)移能力相關(guān)的特定基因。ACTG2與HCC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，沉默的ACTG2即ACTG2mut具有較低的遷移能力。pDisrup定位插入于ACTG2的5′-基因（起始密碼子129 bp），從而導(dǎo)致截短。利用Western Blot實驗和細胞免疫熒光測定ACTG2是否在HepG2細胞中被干擾。如圖1A-B所示，ACTG2mut細胞中ACTG2的表達大大降低。如圖1C所示，對照細胞的劃傷面積恢復(fù)56%，然而，ACTG2mut細胞劃傷面積恢復(fù)縮小32%并且無法閉合傷口。這與Transwell實驗結(jié)果一致，ACTG2mut細胞遷移穿過Transwell的膜，使之遷移率大大降低，見圖1D。為了確定ACTG2表達的臨床相關(guān)性，分析人類蛋白質(zhì)圖譜（www.proteinatlas.org）的臨床標本中ACTG2表達，發(fā)現(xiàn)ACTG2在肝癌中具有陽性強表達，在正常肝臟中具有陰性弱表達，如圖1E。ACTG2在HCC細胞系中表達水平較高，但在正常肝細胞LO2中顯著降低（見圖1G）。qRT-PCR實驗顯示，ACTG2過表達是由于ACTG2 mRNA水平的增加（見圖1H），提示ACTG2的過表達促進HCC細胞轉(zhuǎn)移。

圖1 鑒別ACTG2在肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用

3.2 內(nèi)源性ACTG2體外調(diào)節(jié)HCC細胞轉(zhuǎn)移

為了確認ACTG2是影響HCC細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，設(shè)計了干擾ACTG2的shRNA、將其轉(zhuǎn)染于SMMC-7721細胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SMMC-7721-shACTG2細胞，如圖2A所示。接下來去闡明SMMC-7721細胞侵襲轉(zhuǎn)移的降低是否由于shRNA干擾、使得ACTG2基因沉默。在劃痕實驗中，與對照細胞相比，SMMC-7721-shACTG2細胞其遷移率大大降低（見圖2B）。Transwell實驗也顯示出一致的趨勢，SMMC-7721-shACTG2細胞侵襲顯著減弱（見圖2C）。進一步考察ACTG2是否可以調(diào)節(jié)HCC細胞增殖，MTT實驗和集落形成實驗結(jié)果表明，在對照組細胞和SMMC-7721-shACTG2細胞之間的增殖沒有明顯差異（見圖2D）。綜合考慮，ACTG2 shRNA可以抑制HCC細胞的侵襲能力。

圖2 shACTG2對肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

3.3 內(nèi)源性ACTG2體內(nèi)調(diào)節(jié)HCC細胞轉(zhuǎn)移

為了證實ACTG2在肝細胞轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用，構(gòu)建穩(wěn)定過表達ACTG2的HepG2細胞中ACTG2-OE，見圖3A。ACTG2過表達顯著增加了HepG2細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力（見圖3B-C）。最后，為了確定ACTG2-OE是否也導(dǎo)致體內(nèi)HCC侵襲與轉(zhuǎn)移的增加，將HepG2細胞、ACTG2-OE的HepG2細胞以及SMMC-7721-shACTG2細胞尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，建立實驗性轉(zhuǎn)移模型。如圖3D所示，ACTG2-OE的HepG2細胞產(chǎn)生的癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移性損傷數(shù)量顯著增加，相反，轉(zhuǎn)染shACTG2的SMMC-7721細胞導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)的減少。

4 討 論

HCC是具有高轉(zhuǎn)移潛力的、死亡風(fēng)險最高的實體癌。癌轉(zhuǎn)移是一個逐步的過程，主要依賴于宿主與癌細胞之間復(fù)雜微環(huán)境[7]。然而，目前尚無有效治療方法解決肝癌侵襲轉(zhuǎn)移問題，原因歸咎于肝癌轉(zhuǎn)移機制的復(fù)雜性[8]。

最近研究表明，ACTG2在惡性腫瘤中起著重要作用，ACTG2的過度表達在不同類型癌癥的惡性進展中起重要作用[8]。在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，ECM蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示ACTG2表達上調(diào)。另外ACTG2在前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、睪丸癌和口腔鱗狀細胞癌等侵襲性腫瘤中均有上調(diào)，該因子可用于惡性腫瘤的進展評價。到目前為止，未見到ACTG2在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用。在Mas肝臟數(shù)據(jù)庫[9]和Wurmbach肝臟數(shù)據(jù)庫[10]（圖1F）中都顯示出肝癌組織中ACTG2 mRNA水平明顯高于正常肝組織?；谖墨I的研究，我們設(shè)計實驗并最初發(fā)現(xiàn)ACTG2在肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的新特性[11]。

在本研究中，為了識別參與HCC侵襲轉(zhuǎn)移的基因，采用專門設(shè)計的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（pDisrup）轉(zhuǎn)染人肝癌細胞，pDisrup可以隨機干擾基因組中的任何基因。通過殺稻瘟菌素Blasticidin S篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，然后通過劃痕實驗檢測其遷移潛能。采用3′RACE、即利用PCR進行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，對具有增加或降低遷移潛力的細胞克隆，進一步確定涉及HCC細胞轉(zhuǎn)移的特定基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACTG2參與HCC細胞的細胞侵襲轉(zhuǎn)移。當ACTG2基因被插入突變破壞時，HepG2侵襲與轉(zhuǎn)移被顯著抑制。劃痕實驗和Transwell實驗顯示，當ACTG2基因沉默時，HCC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著削弱。相比之下，過表達ACTG2使得HCC的侵襲轉(zhuǎn)移能力大大增強。更令人信服的是，沉默ACTG2顯著地減少了SMMC-7721細胞在裸鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移和體外的遷移率。在本研究中，發(fā)現(xiàn)了ACTG2促進了HCC細胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，此結(jié)果可能為干預(yù)HCC治療提供了新的靶標，從而改善了治療HCC的現(xiàn)狀。

圖3 闡明ACTG2-OE在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用