顧芬芬，胡楚玲，臺宗光，高 申，陳中建，3*

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥學(xué)部，上海200092；2海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海200092；3上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬皮膚病性病醫(yī)院藥學(xué)部，上海200050

世界每年新發(fā)前列腺癌患者達(dá)1800萬人次[1]，早期診斷是其治療的關(guān)鍵。超聲檢查是前列腺疾病診斷的主要手段[2]，清晰的、特異性的顯影是提高前列腺癌早期診斷率的關(guān)鍵。然而，傳統(tǒng)的造影劑在超聲透射中不夠穩(wěn)定，分布較為擴(kuò)散，造影回聲較差[3，4]，且其非特異性顯影常常導(dǎo)致前列腺癌的早期診斷率下降或錯誤診斷的發(fā)生[5-7]。

正常組織的血管內(nèi)皮間隙緊密，大分子和脂質(zhì)顆粒不易透過血管壁，而腫瘤組織血管豐富且血管內(nèi)皮間隙較寬，因此特定粒徑的脂質(zhì)顆粒物質(zhì)可以通過并滯留，這種腫瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)簡稱高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）[8，9]。此中有無機(jī)納米材料——多壁碳納米管。由于其特定的粒徑具有EPR效應(yīng)，從而可實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的被動靶向效應(yīng)。通過共價結(jié)合腫瘤部位靶向的特定配體可實(shí)現(xiàn)腫瘤主動靶向作用[8]。前期實(shí)驗(yàn)將多壁碳納米管進(jìn)行了聚乙二醇（PEG）水化后，采用前列腺特異性膜抗原（PSMA）特異靶向結(jié)合的核苷酸適體A10-3.2修飾，制備出前列腺癌靶向的納米超聲造影劑，并對其進(jìn)行了初步評價[10]。本課題中，對該納米靶向造影劑的細(xì)胞攝取、體內(nèi)靶向性及顯影性作了進(jìn)一步評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器

激光共聚焦顯微鏡（Thorlabs，America）；流式細(xì)胞儀（賽默飛FlowCAM?8100）；超聲造影儀（90 scanner，Esaote Medical Systems，Genova，Italy）；活體成像儀（Bio-Real奧地利）。

1.2 材料

多壁碳納米管（Brattleboro，VT，USA）；NH2-PEGCOOH（MW：2000，BO生物科技有限公司）；核苷酸適體及PEG修飾的多壁碳納米管MWCNT-PEGAp（前期實(shí)驗(yàn)制備）；EDC、NHS（阿拉丁生物科技有限公司）；香豆素-6（賽默飛生物科技）；DAPI、DMEM、FBS、青霉素（Life Technologies）；鏈霉素（本市醫(yī)藥公司）；抗PSMA適體A10-3.2（5′-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU-3′，銳博生物科技有限公司）；DIR（1，1‘-dioctadecyl-3，3，3’，3‘-tetramethylindotricarbocyanine iodide，北京泛博生物化學(xué)有限公司）。

1.3 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

過表達(dá)PSMA抗原的前列腺癌PC3細(xì)胞購自于中科院上海分院。利用RPMI1640+10%FBS+1%青霉素+1%鏈霉素于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2天消化傳代，一傳二，所有細(xì)胞培養(yǎng)過程嚴(yán)格按照培養(yǎng)規(guī)程及無菌條件操作。

1.4 動物

雄性BALB/c裸鼠（4周大小）由第二軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，作SPF級別飼養(yǎng)。許可證號：SCXK（滬）2012-0002。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)中心規(guī)章制度及第二軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會規(guī)定實(shí)施。

2 方 法

2.1 細(xì)胞攝取流式考察

以香豆素6為熒光標(biāo)記物。取1 mg香豆素6，MWCNT-PEG-Ap 50 mg，室溫避光攪拌6 h，純凈水離心洗滌3次，得包裹香豆素6的納米超聲造影劑。

對數(shù)生長期的PC3細(xì)胞采用RPMI 1640+10%FBS+1%青霉素+1%鏈霉素于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，鋪12孔板。每孔2×105個，培養(yǎng)24 h，使其充分貼壁，更換新鮮含有不同濃度包載香豆素6的納米超聲造影劑或單體香豆素6的培養(yǎng)基溶液，孵育3 h，PBS洗滌3次，消化，離心收集細(xì)胞，懸浮于0.5 mL PBS中，流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度，定量考察納米超聲造影劑細(xì)胞攝取情況。

2.2 細(xì)胞攝取共聚焦顯微鏡考察

對數(shù)生長期的PC3細(xì)胞鋪24孔板，每孔中放置一枚蓋玻片，每孔105個細(xì)胞，24h充分貼壁后，更換新鮮含有包載香豆素6的納米超聲造影劑或含有單純香豆素6的培養(yǎng)液（香豆素6濃度為100 ng·mL-1），孵育4 h，PBS清洗3次，4%甲醛固定0.5 h，DAPI染色0.5 h后PBS洗滌3次，采用封片液封片，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取情況。

2.3 體內(nèi)超聲顯影考察

采用裸鼠移植瘤模型為體內(nèi)考察模型。對數(shù)生長期PC3細(xì)胞，以107個/mL的濃度皮下種植于4周大小雄性裸鼠右上臂，當(dāng)腫瘤長至0.8~1 cm時，將裸鼠隨機(jī)分為3組：（a）PBS、（b）MWCNT-PEG、（c）MWCNT-PEG-Ap。每組尾靜脈注射相應(yīng)溶液后，采用2%的戊巴比妥溶液麻醉，于給藥1、8、24 h觀察裸鼠腫瘤、心臟、腎臟部位的超聲顯影效果。

2.4 體內(nèi)靶向性研究

采用裸鼠移植瘤模型作體內(nèi)考察。對數(shù)生長期PC3細(xì)胞，以107個/mL的濃度皮下種植于4周大小雄性裸鼠右上臂，當(dāng)腫瘤長至0.8~1cm時，將裸鼠隨機(jī)分為3組：（a）PBS、（b）DIR、（c）MWCNT-PEG-Ap-DIR。每組尾靜脈注射相應(yīng)溶液8 h，取出裸鼠心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，對其進(jìn)行熒光信號采集。

2.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間統(tǒng)計差異比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 細(xì)胞攝取流式情況

有效的細(xì)胞攝取是納米超聲造影劑進(jìn)入腫瘤部位的前提條件，因此采用PC3細(xì)胞為模型細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀定量考察其細(xì)胞的攝取情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 流式細(xì)胞攝取圖

由圖1表明，多壁碳納米管在低濃度時細(xì)胞攝取呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，而當(dāng)濃度增加到200μg·mL-1時，細(xì)胞攝取量幾乎達(dá)到100%，且相比于對照組單體而言，納米超聲造影劑能夠有效地被細(xì)胞所攝取。

3.2 細(xì)胞攝取共聚焦情況

采用PC3細(xì)胞考察細(xì)胞攝取納米造影劑的情況及其在細(xì)胞內(nèi)分布狀況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 納米造影劑細(xì)胞攝取激光共聚焦顯微鏡圖

由圖2可知，納米造影劑相比于單體香豆素6能夠有效地被細(xì)胞攝取，其結(jié)果與流式定性結(jié)果相一致。DAPI為細(xì)胞核染色試劑，香豆素6的綠色熒光與核染的藍(lán)色熒光幾乎無重疊，說明該納米造影劑分布于細(xì)胞質(zhì)中，提示其無核酸侵襲性。

3.3 體內(nèi)超聲造影情況

對造影劑的體內(nèi)顯影情況做進(jìn)一步的考察，以PBS為對照組，考察給予造影劑1、8、24 h后，腫瘤部位及心臟、腎臟的顯影情況，以評價該納米造影劑腫瘤診斷效果及體內(nèi)的分布、代謝情況，結(jié)果如 圖3所示。

圖3 體內(nèi)顯影效果圖

由圖3可知，PBS幾乎無任何顯影作用，腫瘤、腎臟、心臟部位在給藥后均不可見。尾靜脈注射納米造影劑后1 h，隱約可見腫瘤；給予造影劑8 h后腫瘤部位顯影明顯，且MWCNT-PEG-Ap組較MWCNT-PEG組更為清晰、明亮，說明適體修飾后該納米造影劑更具腫瘤靶向性；給予造影劑24h后，腫瘤部位顯影變?nèi)?，說明納米造影劑發(fā)生了代謝。

對代謝器官腎臟進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，該造影劑經(jīng)過腎臟代謝，在造影劑給予8 h后腎臟顯影尤為明晰；而24 h后，腎臟顯影衰退，說明該造影劑已經(jīng)大部分代謝排出體外，也提示該造影劑體內(nèi)蓄積時間短，毒性較小。由心臟顯影情況可知，該造影劑幾乎無心臟分布，進(jìn)一步提示該造影劑靶向性良好，毒性低。

3.4 體內(nèi)靶向性

對造影劑體內(nèi)靶向性進(jìn)行深入考察，以DIR為熒光標(biāo)記物，注射8 h后考察熒光在體內(nèi)各臟器的分布情況，其結(jié)果如4所示。

由圖4可知，游離的熒光劑單體在體內(nèi)各臟器中均有分布，而納米超聲造影劑無心臟和脾臟分布，且絕大多數(shù)分布于腫瘤組織中，具有一定的腫瘤靶向性，此結(jié)果提示該造影劑靶向性良好，毒性較低。

圖4 體內(nèi)靶向性顯影圖

4 討論

本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，對核酸適體修飾的納米超聲靶向造影劑作進(jìn)一步考察與研究，結(jié)果表明，此新型造影劑具有良好的體外細(xì)胞攝取、體內(nèi)靶向性和顯影性。良好的細(xì)胞攝取是納米材料產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)[11，12]，此種新型納米造影劑可有效地被細(xì)胞攝取，且攝取后無細(xì)胞核侵襲性。更重要的是，該造影劑在體內(nèi)具有較強(qiáng)的靶向顯影作用，且體內(nèi)主要經(jīng)由腎臟代謝，無心臟分布。因此本課題研究證明，此種新型納米超聲造影劑安全、有效、靶向性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的臨床轉(zhuǎn)化潛力[13，14]。