王 蕾，王麗萍，董純明，李小義，李登峰,邵宗澤

(1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.自然資源部第三海洋研究所、海洋生物 遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

氮素循環(huán)是整個生物圈物質與能量循環(huán)的關鍵組成，也是海洋生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)的重要組成部分，對維持海洋生態(tài)平衡和修復意義重大[1].自20世紀80年代起，人們將海洋資源的可持續(xù)開發(fā)與利用作為資源與環(huán)境科學的主要發(fā)展戰(zhàn)略之一[2]，同時國際上也將海洋氮、磷等營養(yǎng)元素的生物地球化學循環(huán)列為研究重點[3-4].海洋氮循環(huán)是一個復雜的生物地球化學過程，主要由微生物驅動，包括固氮過程、同化作用、硝化作用、厭氧氨氧化過程和反硝化作用等[5].硝酸鹽、亞硝酸鹽和氨氮等氮素是氮循環(huán)過程中的重要物質基礎，同時也是良好的電子供/受體.微生物對硝酸鹽等氮源的變化十分敏感，許玫英等(2014)通過向珠江三角洲流域受污染的河流沉積物中注入硝酸鹽，改變沉積物氧化還原微環(huán)境，研究微生物對硝酸鹽注入的響應，發(fā)現(xiàn)沉積物微生物群體對硝酸鹽濃度的變化很敏感，微生物群落多樣性增加，參與氮循環(huán)的功能基因被富集[6].近年來，人們對微生物參與的氮循環(huán)各環(huán)節(jié)在海洋物質循環(huán)、生態(tài)平衡、環(huán)境污染、新生產力估算等方面的重要作用愈加重視[7-10].國內研究者也相繼在近海各海域進行了相關的研究[11-13].但是參與深海氮素循環(huán)的有關研究不多，關于南海深海原位環(huán)境中氮循環(huán)微生物對各類無機氮源增加的響應情況也鮮有報道.

為了認識深海微生物對外來氮源輸入的響應情況，本研究利用課題組首次研制的深海水體原位定植培養(yǎng)系統(tǒng)，通過投加銨鹽、硝酸鹽等對南海深海水體中可能參與氮循環(huán)的微生物類群進行原位富集.同時基于Illumina高通量測序技術，對南海原位富集樣品和實驗室二次富集樣品進行微生物多樣性分析，并進一步通過平板分離培養(yǎng)方法對南海深海氮循環(huán)微生物進行可培養(yǎng)菌多樣性分析，以期更好地認識細菌在深海氮循環(huán)中的作用.

1 材料與方法

1.1 深海原位富集與樣品采集

本研究利用自主研制的深海水體原位定植培養(yǎng)系統(tǒng)，于2015年5月中旬，在南海北部海盆(21°19.582′N，119°27.207′E)深度為3300m的深海近底海水中，通過向1個循環(huán)式富集培養(yǎng)倉(3dm3)中添加氯化銨、緩釋營養(yǎng)鹽顆粒(含硝酸鹽、銨鹽和尿素)作為氮源，同時在富集倉內填充脫脂棉等作為微生物附著基質，開展了氮循環(huán)相關微生物的原位富集試驗.經過17個月的原位富集后，于2016年10月24日成功回收該原位定植培養(yǎng)系統(tǒng)，獲得1個富集倉樣品，培養(yǎng)倉外觀良好，脫脂棉樣品和倉內水樣渾濁程度不明顯.樣品采集后將脫脂棉和倉內水樣分別于4℃和-20℃保藏(圖1).對該富集倉內的脫脂棉樣品(NH_MH)和艙內水樣(NH_SY)分別處理，每個樣品取兩個平行進行后續(xù)多樣性分析.

圖1 南海深海水體原位富集設備和樣品的回收Fig.1 Recovery of the in-situ enrichment equipment and samples from the deep-sea water in the South China Sea圖a、b為循環(huán)式富集培養(yǎng)倉示意圖；圖c為4℃冷藏富集樣品；圖d為-20℃凍存富集樣品

1.2 培養(yǎng)基

R2A：酵母浸粉0.5g，胰蛋白胨5g，酪蛋白水解酶0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.3g，硫酸鎂0.05g， 瓊脂15g，海水1dm3，調pH 為7.2±0.2.

MA：蛋白胨5g，酵母浸粉1g，檸檬酸鐵0.1g，氯化鈉19.45g，氯化鎂8.8g，硫酸鈉3.24g，氯化鈣1.8g，氯化鉀0.55g，碳酸氫鈉0.16g，溴化鉀0.08g，氯化鍶34mg，硼酸22mg，硅酸鈉4mg，氟化鈉2.4mg，硝酸銨1.6mg，磷酸氫二鈉8mg，瓊脂15g，純水1dm3，調pH為7.6±0.2.

1/3MA：保持氯化鈉和瓊脂含量不變，其他成分減少到MA的1/3， 調pH 為7.6±0.2.

反硝化分離培養(yǎng)基(MDM)：乙酸鈉2.9g，二水合檸檬酸三鈉3.5g，琥珀酸鈉4.8g，氯化鈉30g，磷酸二氫鉀2g，磷酸氫二鈉3g，七水硫酸鎂0.05g，七水硫酸亞鐵0.02g，氯化鈣0.02g，碳酸氫鈉0.5g，硝酸鈉0.6g，亞硝酸鈉0.5g，微量元素1cm3，維生素各1cm3，瓊脂15g，純水1dm3， 調pH為7.8±0.2.

1.3 原位富集樣品總DNA提取

原位富集樣品總 DNA 的提取過程參照 Steffen 等(2012)的方法[14].首先對不同材質樣品進行預處理：水樣樣品用0.22μm的濾膜過濾，收集菌體；脫脂棉樣品用無菌的剪刀剪成0.3cm×0.3cm的小塊.然后利用美國MO BIO公司的水樣基因組提取試劑盒(14900-100-NF，PowerWater?DNA Isolation Kit)提取樣品總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和nanodrop2000超微量分光光度計檢測提取DNA質量，并于-80℃冰箱中保存.

1.4 原位富集樣品高通量測序和分析

提取富集樣品的總DNA，送至美吉基因上海分公司進行測序分析.本次Illumina高通量測序靶標為細菌和古菌16S rRNA基因可變區(qū)V3-V4區(qū).細菌擴增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，長約468bp；古菌擴增引物524F_10_ext(5′-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3′)和Arch958R_mod(5′-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3′)，長約434bp.采用Paired-end(PE)300測序策略，對樣品meta DNA進行測序[15].并對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，對標準化后的序列進行多樣性分析[16]：基于有效數(shù)據(jù)將相似性達97%的序列進行OTU(Operational Taxonomic Unit)聚類.采用RDP classifier貝葉斯算法[17]對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各水平統(tǒng)計每個樣品的群落組成.基于OTU聚類分析結果，對OTU進行多種多樣性指數(shù)分析，如Alpha多樣性指數(shù)，主要包括Chao值、Simpson指數(shù)、Shannon值和ACE值等；基于分類學信息對各樣本的物種組成進行了深入的分析，主要包括群落Heatmap圖、群落結構組分圖和樣本聚類樹與柱狀圖等，在上述分析的基礎上，進行一系列群落結構和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計學和可視化分析.

1.5 原位富集樣品可培養(yǎng)菌分離鑒定

對南海原位富集樣品進行10倍梯度稀釋，取100mm3的10-2、10-3和10-4稀釋梯度菌懸液涂布于R2A、1/3MA 和MDM3種固體培養(yǎng)基上，分別于10℃和28℃2個培養(yǎng)溫度下倒置培養(yǎng)，待平板上長出單菌落，根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏色、暈環(huán)等表型特征，于相應平板上劃線分離不同的單菌落，置于相應溫度培養(yǎng).經2～3次分離純化后，獲得細菌的純培養(yǎng)物，用25%的甘油保種，-80℃保存.并通過菌落PCR方法擴增各菌株16S rRNA基因全長序列.PCR擴增引物為：細菌通用引物Eubac27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，Eubac1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′)；擴增條件為：變性94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min30s，共30個循環(huán)；延伸：72℃，10min.PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行測序.利用 MEGA5.05軟件中 ClustalW 的方法進行多序列比對，通過鄰位加入法(neighbor joining method)構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.6 實驗室二次富集

硝酸鹽氮測定采用鋅鎘還原法測定[18]；亞硝酸鹽氮測定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法[18]；銨鹽測定采用次溴酸鈉氧化法[18].氧化亞氮氣體采用氣相色譜儀(Agilent7890B)測定；氮氣測定采用穩(wěn)定同位素比質譜法.

1.7 二次富集樣品高通量測序和序列分析

對實驗室二次富集樣品提取總DNA，進行測序分析.利用 Ilummina Miseq 測序平臺對樣品進行細菌16S rRNA基因測序和多樣性分析，測序靶標、策略以及多樣性分析方法同“1.4”.

1.8 富集物可培養(yǎng)細菌的分離鑒定及反硝化功能驗證

對實驗室二次富集樣品進行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5和10-6稀釋梯度菌懸液涂布到MA和相應富集培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，相應培養(yǎng)溫度下倒置培養(yǎng).單菌分離培養(yǎng)鑒定及構建發(fā)育樹的方法同“1.5”.

2 結果與討論

2.1 深海原位富集樣品的微生物多樣性

采用Illumina miseq測序平臺對南海深海原位富集物的脫脂棉樣品(NH_MH1、NH_MH2)和倉內水樣(NH_SY1和NH_SY2)進行16S rRNA基因高通量測序.共測得531 658條有效序列，其中包括4個樣品測得的245 706條細菌有效序列，3個樣品(NH_SY2古菌序列測序失敗)測得的285 952條古菌有效序列，片段平均長度在441～449 bp之間.將得到的序列進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，得到178 668條細菌有效序列和134 001條古菌有效序列，按照97%相似度對序列進行OTU聚類，共得到515個OTUs，包括466個細菌OTUs和49個古菌OTUs.基于OTU聚類分析結果，對樣本的Alpha多樣性指數(shù)(主要包括Chao值、Simpson指數(shù)、Shannon值和ACE值等)進行分析，如表1所示，可以看出南海深海氮源原位富集樣品中的微生物種類豐富.稀釋曲線分析表明，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩(圖2)，表明該測序量已經能夠反映該實驗中細菌和古菌群落多樣性.

表1 南海深海氮源原位富集樣品的細菌與古菌Alpha多樣性參數(shù)Tab.1 Alpha diversity parameters of bacteria and archaea from the in-situ samples enriched with nitrogen sources from the deep-sea water in the South China Sea

圖2 南海深海氮源原位富集樣品細菌和古菌序列稀釋度曲線Fig.2 Rarefaction curve of bacteria and archaea sequences from the in-situ samples enriched with nitrogen sources from the deep-sea water in the South China Sea

采用RDP classifier貝葉斯算法[17]對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，富集倉內4個樣品所獲的細菌序列歸屬細菌域的21個門，37個綱，91個目，173個科，290個屬和363個種.細菌物種組成(圖3、4)分析表明，變形菌門豐度最高，在脫脂棉(NH_MH1和NH_MH2)和艙內水樣(NH_SY1和NH_SY2)中相對豐度為75%以上，尤其是以脫脂棉為附著介質的樣品中相對豐度超過90%.此外，門水平上相對豐度大于1%的還包括厚壁菌門、藍細菌門、擬桿菌門、放線菌門和棲熱菌門. 從屬水平來看，脫脂棉(NH_MH1和NH_MH2)和倉內水樣(NH_SY1和NH_SY2)中菌群多樣性差異顯著，脫脂棉樣品中最優(yōu)勢的種屬為希瓦氏菌屬(Shewanella)，相對豐度超過50%，其他相對豐度超過1%的優(yōu)勢菌屬還包括：假單胞菌屬(Pseudomonas)、科韋爾氏菌屬(Colwellia)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、摩提亞氏菌屬(Moritella)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)；倉內水樣中的最優(yōu)勢種屬為科韋爾氏菌屬，在兩個樣品中相對豐度分別為49.8%和82.1%，其他相對豐度超過1%的菌屬還包括： 鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、擬色球藻屬(Chroococcidiopsis)、湖沉積桿菌屬(Limnobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、奇異球菌屬(Deinococcus)、柄球菌屬(Craurococcus)、薄層菌屬(Hymenobacter)和丙酸桿菌屬(Propionibacterium).此外還有一些不能準確注釋到屬的序列分類，它們在脫脂棉(NH_MH1和NH_MH2) 和艙內水樣(NH_SY1和NH_SY2)4個樣品中的相對豐度分別為3.6%、3.7%、10.0%和1.9%.

圖3 南海深海氮源原位富集樣品中門水平細菌和古菌群落組成Fig.3 Microbial community composition analysis of bacteria and archaea at phylum level from the in-situ samples enriched with nitrogen sources from the deep-sea water in the South China Sea

圖4 南海深海氮源原位富集樣品中屬水平細菌群落組成熱圖Fig.4 Heatmap of bacteria populations at genus level from the in-situ samples enriched with nitrogen sources from the deep-sea water in the South China Sea

圖5 南海深海氮源原位富集樣品中屬水平古菌群落組成Fig.5 Microbial community composition analysis of archaea at genus level from the in-situ samples enriched with nitrogen sources from the deep-sea water in the South China Sea

圖6 基于 16S rRNA 基因序列構建的南海深海氮源原位富集樣品可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of culturable bacteria isolated from the in-situ samples enriched with nitrogen sources from the deep-sea water in the South China based on 16S rRNA gene sequences

古菌物種組成(圖3、5)分析表明，3個樣品(NH_MH1、NH_MH2和NH_SY1)的古菌序列歸屬于古菌域的4個門，11個綱，15個目，17個科，20個屬的28個種.古菌物種組成分析可知，奇古菌門和廣古菌門豐度較高，其中奇古菌門在脫脂棉樣品中相對豐度為80%左右，在NH_SY1中相對豐度超過65%；廣古菌門在水樣中相對豐度較高，在NH_SY1中為31.7%，在脫脂棉樣品NH_MH1和NH_MH2中相對豐度分別為11.2%和2.5%.此外，門水平上相對豐度大于1%的還包括Parvarchaeota，主要存在于脫脂棉樣品中，在NH_MH1和NH_MH2中相對豐度分別為9.2%和15.4%.從屬水平來看，CandidatusNitrosotalea相對豐度最高，在脫脂棉樣品NH_MH1和NH_MH2中分別為33.6%和38.2%，在NH_SY1中相對豐度為41.7%.此外，相對豐度高于1%的屬還包括甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、CandidatusNitrosopelagicus、CandidatusNitrosocosmicus、CandidatusNitrosopumilus和甲烷桿菌屬(Methanobacterium).其中甲烷短桿菌屬主要存在于NH_SY1中，相對豐度為14.6%；CandidatusNitrosopelagicus和CandidatusNitrosocosmicus主要存在于脫脂棉樣品中，CandidatusNitrosopelagicus在NH_MH1和NH_MH2中相對豐度分別為13.9%和5.9%，CandidatusNitrosocosmicus在NH_MH1和NH_MH2中相對豐度分別為10.1%和4.8%；CandidatusNitrosopumilus主要存在于NH_MH2中，相對豐度為5.5%；甲烷桿菌屬主要存在于NH_MH1中，相對豐度為6.8%.此外，還有大量不能準確注釋到屬的序列，如norank_c_FHMall_terrestrial_group等.這些序列在脫脂棉樣品(NH_MH1和NH_MH2)和艙內水樣(NH_SY1)中相對豐度分別為33.0%、43.8%和43.7%.

2.2 原位富集樣品中可培養(yǎng)細菌多樣性

將南海深海氮源原位富集樣品在1/3MA、R2A和MDM培養(yǎng)基上直接稀釋涂布，10℃和28℃兩個培養(yǎng)溫度共分離得到17株細菌，包括2個門，3個綱，10個屬，12個種，14個OTUs.系統(tǒng)進化分析如圖6所示，結果表明，原位富集樣品分離得到的菌主要包括γ-變形菌綱的鹽單胞菌屬(Halomonas)、海桿菌屬(Marinobacter)和嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)，以及α-變形菌綱的亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)、橙單胞菌屬(Aurantimonas)、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas)、赤桿菌屬(Erythrobacter)，同時還包括少量放線菌門細菌，如迪茨氏菌屬(Dietzia)、Chryseoglobus屬和微桿菌屬(Microbacterium).

2.3 不同氮源的實驗室二次富集

2.4 原位富集樣品的實驗室二次富集細菌多樣性

采用Illumina miseq測序平臺對實驗室二次富集的5個樣品進行細菌16S rRNA基因高通量測序，共獲得352 572條有效序列，片段平均長度449 bp左右.對序列進行拼接、質控和過濾，得到275 495條有效序列，按照97%相似度對序列進行OTU聚類，共得到25個OTUs.基于OTU聚類分析結果，對樣本的Alpha多樣性指數(shù)進行分析，各樣本Alpha多樣性指數(shù)如表3所示，與原位富集樣品相比，樣品經實驗室條件下的二次選擇性富集后，后者OTU數(shù)目、Shannon指數(shù)遠遠小于前者，說明實驗室二次富集后微生物的多樣性降低.

采用RDP classifier貝葉斯算法[17]對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，可知樣品測得序列歸屬于細菌域的4個門， 5個綱，9個目，14個科，14個屬，18個種.該原位富集樣品經過實驗室的第二次選擇性富集后細菌種屬組成(圖7)較為單一，獲得的5個富集組樣品均以變形菌門為主，以γ-變形菌綱占絕對優(yōu)勢，相對豐度超過99%.在屬水平上，氨氮、硝態(tài)氮富集組3個樣品以鹽單胞菌屬為主，相對豐度超過90%，此外氨氮富集組相對豐度大于1%的菌屬還包括假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)；硝態(tài)氮富集組還包括海源菌屬(Idiomarina)和假交替單胞菌屬；亞硝態(tài)氮富集組最優(yōu)勢菌屬包括鹽單胞菌屬和海桿菌屬，此外，相對豐度大于1%的菌屬還有假交替單胞菌屬.

2.5 二次富集樣品中可培養(yǎng)細菌分析及反硝化功能驗證

對二次富集樣品進行可培養(yǎng)菌分離鑒定，共篩選獲得9株細菌，包括5株鹽單胞菌和4株海源菌，系統(tǒng)進化分析如圖8所示.5株鹽單胞菌與最近源的模式菌HalomonastitanicaeBH1T的16S rRNA基因同源性在99.22%～99.93%，4株海源菌與最近源的模式菌IdiomarinatainanensisPINIT的16S rRNA基因同源性在98.34%～98.42%.

表2 5個實驗室二次富集物樣品的氮轉化情況Tab.2 Nitrogen conversion rate of five secondary enrichments in laboratory

注：“-”表示未測

表3 5個實驗室二次富集物的細菌Alpha多樣性Tab.3 Alpha diversity of bacteria from five secondary enrichments in laboratory

圖7 5個實驗室二次富集物在屬水平的細菌物種組成分析Fig.7 Bacterial community barplot analysis of five secondary enrichments in laboratory at the genus level

2.6 討論

2.6.1 南海深海氮源原位富集物微生物多樣性分析 對該南海深海氮源原位富集樣品進行Ilummina Miseq測序及多樣性分析，測得序列包含173個科，290個屬的細菌，以及17個科，20個屬的古菌.細菌主要包括變形菌門γ-變形菌綱的希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、科韋氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、摩提亞氏菌屬、短波單胞菌屬、不動桿菌屬和叢毛單胞菌屬等；古菌主要包括奇古菌門的CandidatusNitrosotalea、CandidatusNitrosopelagicus、CandidatusNitrosocosmicus、CandidatusNitrosopumilus等屬.將本實驗中的氮源富集樣品與相同航次同一原位富集設備采集的不添加外源物質的原位上覆水對照組的細菌多樣性進行對比分析，對照組的菌群Shannon 指數(shù)遠高于氮源富集樣品，說明經添加氮源后，相關微生物得到富集，導致多樣性降低.從細菌物種組成來看，對照組相對豐度超過10%的包括變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，其中變形菌門主要以α-變形菌綱和γ-變形菌綱為主(未發(fā)表)；而原位氮源富集樣品以變形菌門γ-變形菌綱為主(相對豐度超過50%)，尤其在脫脂棉附著介質中，相對豐度超過90%，表明經過氮源富集后，γ-變形菌綱得到富集，可能在深海原位氮循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用.原位氮源富集后，脫脂棉附著介質和水體中主要優(yōu)勢種屬分別為希瓦氏菌屬和科韋爾氏菌屬(相對豐度超過50%)，脫脂棉中其它相對豐度超過4%的種屬還包括假單胞菌屬、科韋爾氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和摩提亞氏菌屬；水體中還包括鞘氨醇單胞菌屬、擬色球藻屬和湖沉積桿菌屬，表明吸附材質對原位微生物的多樣性也具有一定選擇性.而對照組樣品在屬水平的物種組成較豐富，均勻度較高，最優(yōu)勢的種屬為亞硫酸鹽桿菌屬(相對豐度在10%左右)，還包括新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)、Glutamicibacter、寡養(yǎng)單胞菌屬等.除了鞘氨醇單胞菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬外，氮源富集樣品中的優(yōu)勢種屬在對照組中的相對豐度都低于1%，這說明在南海深海原位環(huán)境中，氮源的添加刺激了原位環(huán)境中一些低豐度微生物的生長，這部分微生物可能是深海氮循環(huán)的重要參與者.

圖8 基于 16S rRNA 基因序列構建的實驗室二次富集物可培養(yǎng)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of culturable bacteria isolated from the secondary enrichments in laboratory based on 16S rRNA gene sequences

古菌物種組成多樣性結果表明，本次南海原位富集樣品中測得的古菌序列主要歸屬于奇古菌門和廣古菌門.其中奇古菌門廣泛存在于脫脂棉樣品(相對豐度超過80%)和水樣樣品(相對豐度為67%)中.廣古菌門主要存在于水樣樣品(相對豐度為31.7%)中.從屬水平來看，CandidatusNitrosotalea豐度最高，此外還包括CandidatusNitrosopelagicus、CandidatusNitrosocosmicus、CandidatusNitrosopumilus等.其中，CandidatusNitrosopelagicus和CandidatusNitrosopumilus都是海洋環(huán)境中常見的氨氧化古菌.將注釋為CandidatusNitrosotalea的優(yōu)勢OTU在NCBI比對發(fā)現(xiàn)與CandidatusNitrosotaleadevanaterraNd1T同源性達99%，CandidatusN.devanaterraNd1T是Lehtovirta-morley等(2011)從酸性農業(yè)土壤中發(fā)現(xiàn)的嗜酸性氨氧化古菌(AOA)[19]. 注釋為CandidatusNitrosopelagicus的OTU與已報到的海洋生境的AOA CandidatusNitrosopelagicusbrevisCN25T同源性達95%[20]；注釋為CandidatusNitrosocosmicus的OTU與已報到的廢水處理系統(tǒng)的CandidatusNitrosocosmicusexaquare strain G61同源性達99%[21]；注釋為CandidatusNitrosopumilus的OTU與已報到的海洋生境的AOA CandidatusNitrosopumilusmaritimusSCM1T同源性達99%[22].這些優(yōu)勢OTUs與來自于各大洋的克隆子序列同源性也很高，說明它們在海洋環(huán)境中廣泛分布.

南海深海氮源原位富集樣品中，可培養(yǎng)菌主要包括鹽單胞菌屬、海桿菌屬、亞硫酸鹽桿菌屬、橙單胞菌屬、迪茨氏菌屬、細桿菌屬等.而原位富集樣品中的優(yōu)勢菌如希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、科韋氏菌屬、摩提亞氏菌屬等未能獲得分離，可能是實驗室培養(yǎng)條件不適合.希瓦氏菌屬、科韋爾氏菌屬、摩提亞氏菌屬多是嗜冷嗜壓的極端微生物[23-25]，可能在實驗室常壓條件下分離培養(yǎng)幾率較低.

2.6.2 二次富集物細菌多樣性及功能分析 對南海原位氮源富集樣品進行第二次選擇性富集后，得到的富集菌群的微生物多樣性進一步降低.高通量測序表明，各富集組樣品細菌以γ-變形菌綱占優(yōu)勢，相對豐度超過99%.細菌種屬組成單一，主要包括鹽單胞菌屬，其次是海桿菌屬、海源菌屬和假交替單胞菌屬等.通過平板培養(yǎng)分離最終獲得了鹽單胞菌和海源菌.富集參數(shù)測定表明，實驗室富集菌群具有高效的脫氮能力，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮富集組還檢測到了N2或N2O氣體產物，結合可培養(yǎng)菌和不可培養(yǎng)菌多樣性結果可以推測，這些鹽單胞菌、海源菌、海桿菌和假交替單胞菌可能參與深海氮循環(huán)的反硝化過程.有文獻報道[26-29]，鹽單胞菌屬、海桿菌屬中一些種具有硝化、反硝化或異化硝酸鹽還原為銨(Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium，DNRA)能力，參與河口、沉積物、土壤等各種生境的微生物氮循環(huán).Guo等(2013)報道Halomonascampisalisha3同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力[26]；Decleyre等(2015)報道HalomonasdenitrificansM29T具有DNRA的能力[27]；Liu等(2016)報道Marinobacterstrain NNA5具有高效好氧反硝化能力，且最終產物全部為N2，沒有N2O釋放[28].反硝化能力已經成為區(qū)分鹽單胞菌屬不同種的一個重要的系統(tǒng)進化分子標記[30].本研究通過原位富集樣品直接分離得到的鹽單胞菌主要屬于Halomonastitanicae、H.lionenesis和H.aquamarina，實驗室二次富集分離到的鹽單胞菌屬于H.titanicae，目前尚無這3個種屬細菌反硝化能力的相關報道.單菌功能驗證表明本研究分離到的這些菌具有一定的好氧反硝化能力，還有待后續(xù)結合氣體產物測定以及反硝化功能基因分析來進一步證實.

3 結論

本研究首次嘗試利用深海水體原位定植培養(yǎng)系統(tǒng)，在南海深海通過投加外源氮源的方式進行可能的氮循環(huán)相關微生物的原位富集培養(yǎng)，同時通過Ilummina Miseq的16S rRNA基因高通量測序技術結合實驗室富集分離培養(yǎng)方法，研究了南海深海氮源原位富集樣品中微生物群落多樣性.發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱和奇古菌門分別是南海深海氮源原位富集物中的優(yōu)勢細菌和古菌，可能在深海氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用.其中，鹽單胞菌和海源菌等是可培養(yǎng)的優(yōu)勢好氧反硝化菌.總之，本研究對初步認識南海深海參與氮循環(huán)相關微生物的多樣性及其環(huán)境作用提供了參考.