周 洋 , 楊超杰 ,王沛政 ,王海山 ,徐云升, ,李衛(wèi)東

(1. 海南熱帶海洋學(xué)院, 海南 三亞 572022; 2. 海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心, 海南 三亞 572022; 3. 海南大學(xué)海洋學(xué)院, 海南 ?？?570228)

肉芝軟珊瑚屬(Sarcophyton)屬于刺胞動(dòng)物門、珊瑚綱、八放珊瑚亞綱、軟珊瑚目、軟珊瑚科，生長(zhǎng)于3～15 m水深處，廣泛分布在我國(guó)南海海域.它外形如同蘑菇狀，由冠部和莖部組成，冠部表面平滑，呈杯口、花環(huán)和喇叭口等形狀，分布著水螅體和管狀體，水螅體的功能主要是捕食和繁殖[1]，管狀體是一類觸手退化的水螅體，用于進(jìn)行體內(nèi)外水體交換[2]；莖部底部附著在基座上，表面如皮革材質(zhì).

肉芝軟珊瑚研究主要集中在活性物質(zhì)的提取和分離方面，分類學(xué)的研究相對(duì)較少.目前從肉芝軟珊瑚分泌物種發(fā)現(xiàn)并分離了具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等化合物[3-5].自19世紀(jì)以來(lái)國(guó)外學(xué)者主要是通過(guò)珊瑚外部形態(tài)和體內(nèi)含有CaCO3成分的骨針展開肉芝軟珊瑚屬不同種之間的鑒定[2-7]；隨著分子系統(tǒng)學(xué)的快速發(fā)展， France 等(2002)發(fā)現(xiàn)許多線粒體基因在八放珊瑚中具有很高的保守性[8]，還有學(xué)者對(duì)肉芝軟珊瑚的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)做了大量的工作[9-12].Mcfadden等(2010)利用COI+igr1+msh1條形碼對(duì)軟珊瑚進(jìn)行種類鑒定，她認(rèn)為雖然此條形碼不夠完美，但是對(duì)軟珊瑚分類學(xué)的研究是非常有價(jià)值的補(bǔ)充[9].

我國(guó)南海地區(qū)肉芝軟珊瑚資源豐富，藥用價(jià)值極大，國(guó)內(nèi)關(guān)于此種軟珊瑚的分類學(xué)研究也較少.我國(guó)關(guān)于此種珊瑚的分類研究始于20世紀(jì)80年代，李楚璞(1982、1984)對(duì)我國(guó)南海地區(qū)肉芝軟珊瑚進(jìn)行調(diào)查，并在西沙中建島發(fā)現(xiàn)1個(gè)新種即分叉肉芝軟珊瑚(Sarcophytonfurcatum)[13-14]，至今我國(guó)共報(bào)道肉芝軟珊瑚約10種(表1).目前國(guó)內(nèi)對(duì)此種珊瑚的分類研究處于停滯狀態(tài).分類學(xué)家近年來(lái)對(duì)部分種類的修訂并將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于物種鑒定，我國(guó)肉芝軟珊瑚的資源調(diào)查和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究尤為迫切.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

本研究所用的26個(gè)肉芝軟珊瑚樣品分別采自我國(guó)海南省萬(wàn)寧市甘蔗島(18°45′N， 110°30′E)、大洲島(18°40′N，110°28′E)和三亞市西瑁島(18°15′N，109°22′E)3個(gè)地區(qū)的珊瑚礁區(qū).潛水拍照取樣后，將采集的樣品保存于70%乙醇溶液中并編號(hào)(甘蔗島：GZ1～8；大洲島：DZ1～6；西瑁島：XM1～12)后帶回實(shí)驗(yàn)室，用于后續(xù)的骨針?lè)蛛x和DNA提取.

表1 我國(guó)南海地區(qū)已報(bào)道的肉芝軟珊瑚種類Tab.1 Recorded Sarcophyton species in the South China Sea

1.2 骨針的提取和掃描電鏡拍攝

取肉芝軟珊瑚的4個(gè)部位(冠部表皮、冠部?jī)?nèi)組織、莖部表皮、莖部?jī)?nèi)組織)的小塊組織(約1 mm3)，放于10%的次氯酸鈉(NaClO)溶液中分離骨針[6]，然后用超純水清洗幾次，置于1% 的氫氧化鉀(KOH)中去除多余的珊瑚組織；利用光學(xué)顯微鏡觀察骨針表面無(wú)組織的殘留后，放置于載玻片上常溫干燥，最后用掃描電子顯微鏡拍照.獲得的照片使用Adobe Illustrator CS6和Photoshop CC 2種圖片處理軟件對(duì)樣品骨針照片進(jìn)行處理和組合.本研究中的骨針鑒定參考Verseveldt(1982)、Samimi-Namin等(2009)、Benayahu等(2004、2009、2012)、Verseveldt等(1983)的資料[25-30]進(jìn)行比對(duì)分析.

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增

剪取不同樣品組織約10 mg，用超純水反復(fù)清洗幾次，使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(廣州，東盛生物科技有限公司)進(jìn)行樣品DNA提取，然后在Micro-volume Spectrophotometer MN-913A(美國(guó)，Maestrogen)上測(cè)定DNA濃度，然后用于PCR擴(kuò)增.

PCR擴(kuò)增msh1基因的引物為：ND42599F(5′-GCCATTATGGTTAACTATTAC-3′)[8]， Mut-3458R(5′-TSGAGCAAAAGCCACTCC-3′)[31]；擴(kuò)增COI基因的引物為：COIOCTR(5′-ATCATAGCATAGACCATACC-3′)[8]，COII8068F(5′-CCATAACAGGACTAGCAGCATC-3′)[32].反應(yīng)總體積為25 mm3，擴(kuò)增的條件為：95℃預(yù)變性10 min，運(yùn)行35個(gè)以下循環(huán)：95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸50 s，最后72℃延伸10 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司廣州測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序.

1.4 序列分析

利用MEGA 7軟件中Clustal W對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)和人工編輯，并計(jì)算各序列的堿基組成.然后用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap工具1 000次循環(huán)檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與討論

2.1 骨針?lè)治?/h3>

結(jié)果顯示所采集的26個(gè)樣品分屬于5個(gè)種，便于種間的區(qū)分，將其分別標(biāo)注為：Sarcophytonsp.1～5 (圖1).

2.1.1Sarcophytonsp.1 本研究采集此種個(gè)體10個(gè)，編號(hào)分別為：GZ-1、4、7、8; DZ-2、5；XM-8、10、11、12.外部形態(tài)學(xué)特征為：呈扁平狀，冠部直徑為12.0～15.5 cm，高度為8～15 cm，水螅體之間距離為0.5～0.9 mm，水螅體之間有1～3個(gè)管狀體.如圖1所示，Sarcophytonsp.1冠部表層多為棍棒狀骨針(圖2a—d)，頭部較寬，長(zhǎng)度為0.12～0.23 mm，頭部表面有較大的疣狀突起，尾部有矮的、刺狀突起；冠部?jī)?nèi)組織有細(xì)長(zhǎng)的木棍狀和棒狀骨針(圖2e—f)，長(zhǎng)度為0.16～0.19 mm，表面分布著鹿角狀突起.莖部表面骨針多為棒狀(圖2g—i)，頭部較寬，長(zhǎng)度為0.09～0.15 mm，整個(gè)骨針表面都有疣狀的突起；莖部?jī)?nèi)組織骨針為紡錘狀(圖2j—l)，長(zhǎng)度為0.30～0.40 mm，表面有圓形、疣狀和錐形突起.骨針比對(duì)結(jié)果顯示：Sarcophytonsp.1與Sarcophytonehrenbergi(RMNH Coel. no. 6641)的描述基本一致，但本研究中各個(gè)體的莖內(nèi)部骨針形態(tài)變化較大[25].

圖1 海南島附近海域5種肉芝軟珊瑚的水下形態(tài)照片F(xiàn)ig.1 Underwater photographs for growth morphologies of five Sarcophyton colonies in the coastal waters of Hainan Island a—e：Sarcophyton sp.1～5

圖2 Sarcophyton sp.1骨針形態(tài)Fig.2 Sclerites from Sarcophyton sp.1 a—d：冠部表面骨針(左上50 μm標(biāo)尺)；e—f：冠的內(nèi)部骨針(100 μm標(biāo)尺)；g—i：莖的表面骨針(左下50 μm標(biāo)尺)； j—l：莖的內(nèi)部骨針(100 μm標(biāo)尺)

2.1.2Sarcophytonsp.2 本研究采集此種個(gè)體8個(gè)，編號(hào)分別為：GZ-3、6；DZ5、6;XM-2、4、6、9.外部形態(tài)學(xué)特征為：冠部直徑為7～17 cm，高度為5.5～11.5 cm，水螅體之間距離為0.20～0.50 mm，水螅體之間有2～9個(gè)管狀體.如圖3所示，Sarcophytonsp.2冠部表層多為棍棒狀骨針(圖3a—d)，長(zhǎng)度為0.11～0.20 mm，頭部和尾部都具有疣狀突起，頭部的突起更明顯；冠的內(nèi)部組織為紡錘狀骨針(圖3e—f)，長(zhǎng)度為0.45～0.53 mm，表面分布著不規(guī)則的、矮小的錐形和疣狀突起.莖部表層的骨針(圖3g—j)和冠部表層的骨針外形相似，長(zhǎng)度為0.17～0.21 mm；莖的內(nèi)部組織骨針為較長(zhǎng)的(圖3k)紡錘形，長(zhǎng)達(dá)0.70 mm，表面零散的布滿了非常小的刺狀和疣狀的突起.骨針比對(duì)結(jié)果顯示Sarcophytonsp.2與Sarcophytonglaucum(RMNH Coel. no. 13975)的描述基本一致，本研究中各個(gè)樣品的冠部表層骨針的表面突起較明顯，莖的內(nèi)部骨針突起較少[25].

圖3 Sarcophyton sp.2骨針形態(tài)Fig.3 Sclerites from Sarcophyton sp.2 a—d：冠部表面骨針(20 μm標(biāo)尺)；e—f：冠的內(nèi)部骨針(右上100 μm標(biāo)尺)；g—j：莖的表面骨針(50 μm標(biāo)尺)； k：莖的內(nèi)部骨針(右下100 μm標(biāo)尺)

2.1.3Sarcophytonsp.3 本研究采集此種共3個(gè)，編號(hào)分別為：DZ-3、 XM5、 XM7.外部形態(tài)學(xué)特征為：所有個(gè)體高度為14～18 cm，冠部直徑為14～16 cm；兩個(gè)水螅體之間的距離為0.3～0.5 mm，且有5～13個(gè)管狀體.如圖4所示，Sarcophytonsp.3冠部表層多為棍棒狀骨針(圖4a—c)，長(zhǎng)度為0.20～0.29 mm，頭部具有疣狀和錐形突起，尾部也有較矮的疣狀突起；冠的內(nèi)部組織為紡錘狀骨針(圖4e—f)，長(zhǎng)度為0.51～0.62 mm，其表面具有較小的錐形和疣狀突起；莖部表層的骨針(圖4g—j)和冠部表層的骨針外形相似，長(zhǎng)度為0.15～0.20 mm，頭部和尾部都具有疣狀和錐形突起，而且比冠部表層的骨針更明顯；莖的內(nèi)部組織骨針為粗的(圖4d、k)和細(xì)長(zhǎng)的(圖4l—n)紡錘形，長(zhǎng)達(dá)1.03 mm，較粗的骨針表面布滿了疣狀的突起，而細(xì)長(zhǎng)的骨針表面零散的分布著矮小的刺狀突起.骨針比對(duì)結(jié)果顯示Sarcophytonsp.3與Sarcophytoncrassum(MNHN)的描述基本一致[25].

圖4 Sarcophyton sp.3骨針形態(tài)Fig.4 Sclerites from Sarcophyton sp.3 a—c：冠部表面骨針(中間50 μm標(biāo)尺)；e—f：冠的內(nèi)部骨針(右上50 μm標(biāo)尺)；g—j：莖的表面骨針 (左下50 μm標(biāo)尺)；d(中間100 μm標(biāo)尺)，k—n：莖的內(nèi)部骨針(右下100 μm標(biāo)尺)

2. 1.4Sarcophytonsp.4 本研究采集此種3個(gè)，編號(hào)分別為：DZ-1、GZ-2、XM-1.外部形態(tài)學(xué)特征為：所有個(gè)體高度為7～19 cm，冠部直徑為13.0～18.5 cm；兩個(gè)水螅體之間的距離為0.4～1.3 mm，并間有1～6個(gè)管狀體.如圖5所示，Sarcophytonsp.4冠部表層骨針為棍棒狀和啞鈴狀，啞鈴狀在中間的位置有1個(gè)明顯的無(wú)突起區(qū)域；骨針長(zhǎng)約為0.10～0.24 mm，表面不規(guī)則的分布著刺狀突起，(圖5a—c)；冠的內(nèi)部組織同樣為棍棒狀骨針，長(zhǎng)度為0.20～0.25 mm，表面的圓錐形或者疣狀突起更加明顯(圖5f—g).莖部的表層骨針多為啞鈴狀，長(zhǎng)度約為0.10～0.15 mm，表面有刺狀、疣狀和葉狀突起(圖5d—e)；莖的內(nèi)部組織具有特殊的骨針，多為橢圓形或十字形，長(zhǎng)度為0.27～0.34 mm，中間收縮，兩端分布著多刺的、不規(guī)則的疣狀突起(圖5h—j).骨針比對(duì)結(jié)果顯示Sarcophytonsp.4與Sarcophytontrocheliophorum(ZMH no.C2442)的描述基本一致[25]，但兩個(gè)水螅體之間的距離比Verseveldt(1982)所描述的個(gè)體長(zhǎng)[25].

圖5 Sarcophyton sp.4骨針形態(tài)Fig.5 Sclerites from Sarcophyton sp.4 a—c：冠部表面骨針(左上50 μm標(biāo)尺)；d—e：莖的表面骨針(20 μm標(biāo)尺)； f—g：冠的內(nèi)部骨針(左下50 μm標(biāo)尺)；h—j：莖的內(nèi)部骨針(右下50 μm標(biāo)尺)；k：表面疣狀突起(右下50 μm標(biāo)尺)

2. 1.5Sarcophytonsp.5 本研究采集此種2個(gè)，編號(hào)分別為：GZ5、XM3.外部形態(tài)學(xué)特征為：所有個(gè)體的高度為5～9 cm，冠部直徑為9～12 cm，水螅體中心之間的距離為0.1 mm～3.0 mm，兩個(gè)水螅體之間有4～8個(gè)管狀體.如圖6所示，Sarcophytonsp.5冠部表層骨針為棍棒狀，柄部比頭部更細(xì)，長(zhǎng)度為0.15～0.20 mm，表面都有矮的、圓形突起(圖6a—d)；冠的內(nèi)部組織骨針形似紡錘狀，長(zhǎng)度為0.02～0.20 mm，兩頭有大量的小的圓形突起(圖6e).莖部表面的骨片形似冠部表層骨針，長(zhǎng)度為0.05 mm～0.20 mm(圖6f—g)；莖的內(nèi)部骨針為棍棒狀或紡錘狀，表面具有非常明顯尖的、鈍的和疣狀的突起，長(zhǎng)度可達(dá)1.15 mm(圖6h—i).骨針比對(duì)結(jié)果顯示Sarcophytonsp.5與Sarcophytoncherbonnieri(MNHN)的描述基本一致，本研究中各樣本的冠內(nèi)部骨針和莖的內(nèi)部骨針較長(zhǎng)[25].

2.2 序列分析

2.2.1 肉芝軟珊瑚msh1和COI基因序列組成分析 本研究共獲取26條肉芝軟珊瑚樣品的msh1基因部分片斷，將得到的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得GenBank登錄號(hào)為MH040740—MH040765，結(jié)合19條GenBank下載的肉芝軟珊瑚msh1基因序列和1條外群序列Dampiapocilloporaeformis(表2)；通過(guò)比對(duì)和人工編輯，保留共有序列長(zhǎng)度為735 bp，所用序列均無(wú)堿基插入或缺失.通過(guò)對(duì)45條肉芝軟珊瑚msh1基因序列進(jìn)行同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)165個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)115個(gè).所有msh1平均堿基頻率為T：34.2%、C：16.1%、A：31.1%、G：18.6%，A+T(65.3%)含量明顯高于G+C(34.7%)含量，符合肉芝軟珊瑚msh1基因堿基組成特點(diǎn)[33].

圖6 Sarcophyton sp.5骨針形態(tài)Fig.6 Sclerites from Sarcophyton sp.5 a—d：冠部表面骨針(50 μm標(biāo)尺)；e：冠的內(nèi)部骨針(50 μm標(biāo)尺)；f—g：莖的表面骨針 (50 μm標(biāo)尺)；h—i：莖的內(nèi)部骨針(100 μm標(biāo)尺)

研究共獲取26條肉芝軟珊瑚樣品的COI基因部分片斷，將得到的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得GenBank登錄號(hào)為：MH152692—MH152717，結(jié)合11條GenBank下載的肉芝軟珊瑚COI基因序列和1條外群序列Cladiellapachyclados(表2)；通過(guò)比對(duì)和人工編輯，保留共有序列長(zhǎng)度約為869 bp，所用序列均無(wú)堿基插入或缺失.通過(guò)對(duì)37條肉芝軟珊瑚COI基因序列進(jìn)行同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)92個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)80個(gè).所有COI平均堿基頻率為T：36.9%、C：17.1%、A：27.4%、G：18.5%，A+T(64.3%)含量明顯高于G+C(35.6%)的含量.

表2 海南島附近海域及Genbank下載肉芝軟珊瑚msh1和COI基因序列信息Tab.2 msh1 and COI gene sequence information of Sarcophyton in the coastal waters of Hainan Island and downloaded from Genbank

續(xù)表2

圖7 基于msh1基因序列片段的5種肉芝軟珊瑚系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)Fig.7 Phylogenetic tree based on msh1 gene sequences of five Sarcophyton species(Neighbor-joining)

圖8 基于COI基因序列片段的5種肉芝軟珊瑚系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)Fig.8 Phylogenetic tree based on COI gene sequences of five Sarcophyton species (Neighbor-joining)

2.2.2 基于msh1和COI基因序列的肉芝軟珊瑚系統(tǒng)學(xué)關(guān)系 以Dampiapocilloporaeformis為外群，結(jié)合本研究獲得序列和Genebank下載同屬的msh1基因序列; 以Cladiellapachyclados為外群，結(jié)合本研究獲得序列和Genebank下載同屬的COI基因序列.采用鄰接法(NJ)分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7、8).2種基因構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果基本一致，并能將本研究中所有獲得樣品區(qū)分開來(lái).

基于msh1基因構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，Sarcophytonsp.1中DZ-2、GZ-1、GZ-7、GZ-8、XM-8、XM-11和XM-12聚為一支系，而DZ-4、GZ-4和XM-10與S.ehrenbergi和S.mililatensis聚為一支，其他種都非常明顯的可以看出：Sarcophytonsp.2與S.glaucum明顯聚為一支；Sarcophytonsp.3和S.crassum聚為一支；Sarcophytonsp.4與S.trocheliophorum和S.buitendijki聚為一支；Sarcophytonsp.5與S.cherbonnieri聚為一支.基于COI基因構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，Sarcophytonsp.1除了XM-10，其他個(gè)體都與S.ehrenbergi聚在一起，Sarcophytonsp.2與S.glaucum和S.cinereum聚為一支；Sarcophytonsp.3和S.crassum聚為一支；Sarcophytonsp.4與S.trocheliophorum聚為一支；而Sarcophytonsp.5單獨(dú)聚為一支.根據(jù)進(jìn)化樹分析，基本支持形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果.因此將Sarcophytonsp.1～5分別鑒定為:S.cherbonnieri、S.crassum、S.trocheliophorum、S.glaucum和S.ehrenbergi.

2.3 討論

肉芝軟珊瑚外部形態(tài)差異較小，但不同種類軟珊瑚的不同部位骨針之間形態(tài)差異顯著，通過(guò)對(duì)比分析不同部位的骨針形態(tài)來(lái)進(jìn)行種類的鑒定是目前一種常用的軟珊瑚鑒定方法.Verseveldt等(1982)通過(guò)比對(duì)分析肉芝軟珊瑚屬的骨針形態(tài)進(jìn)行較完整的整理修訂，共總結(jié)了35個(gè)種[25]，最近Feussner(2013)從斐濟(jì)發(fā)現(xiàn)了5個(gè)新種[1], 至今世界范圍內(nèi)所報(bào)道的肉芝軟珊瑚屬共有51個(gè)種[1,25-30].Mcfadden等(2006)認(rèn)為軟珊瑚體內(nèi)骨針形態(tài)豐富、多變，目前根據(jù)骨針形態(tài)分類存在一定的困難，需要積累大量的經(jīng)驗(yàn)；對(duì)于不同的分類學(xué)家骨針形態(tài)分析時(shí)具有強(qiáng)烈的主觀性[6]，如Feussner等(2013)和Verseveldt(1982)對(duì)部分同一標(biāo)本的骨針進(jìn)行了提取分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的骨針圖片不相同[ 1, 25].而在本研究中，通過(guò)提取和分析所有個(gè)體的骨針后也發(fā)現(xiàn)：在一個(gè)取樣部位，骨針數(shù)量多，多數(shù)呈現(xiàn)同一種形狀，但也會(huì)出現(xiàn)少數(shù)不同形狀對(duì)分析產(chǎn)生干擾.因此，軟珊瑚骨針的研究還需要更多的工作，或者發(fā)現(xiàn)新的方法作為形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù).

隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，線粒體DNA作為分子標(biāo)記，已經(jīng)成為近緣種間群體遺傳分化的有力工具[34-36].線粒體DNA也作為分子標(biāo)記進(jìn)行軟珊瑚科的分類學(xué)研究，Pontkingdon等(1997)在Sarcophytonglaucum發(fā)現(xiàn)了一種DNA 錯(cuò)配修復(fù)蛋白的基因msh1后[33]，研究者發(fā)現(xiàn)八放珊瑚線粒體DNA在種間差異較小，不太適合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究[37].Mcfadden等(2010)后來(lái)發(fā)現(xiàn)雖然線粒體DNA在八放珊瑚中作為DNA條形碼具有一定的局限性，但是目前針對(duì)肉芝軟珊瑚，COI+igr1+msh1是較好的用于種類區(qū)分的DNA條形碼[9].本研究通過(guò)msh1基因和COI基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)msh1基因和COI基因?qū)Σ糠址N任然難以區(qū)分，可能存在同種異名的可能[6]，因此還需要發(fā)現(xiàn)具有較高區(qū)分度的DNA條形碼對(duì)肉芝軟珊瑚進(jìn)行較全面的系統(tǒng)分類學(xué)研究.

本研究首先進(jìn)行的骨針形態(tài)學(xué)的比對(duì)，將采集的樣品歸為5種，然后采用分子標(biāo)記對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.Sarcophytonsp.3和Sarcophytonsp.5通過(guò)形態(tài)學(xué)能夠清楚的鑒定其種類，并且分子進(jìn)化樹分析也支持了此結(jié)果.Sarcophytonsp.1的外部形態(tài)及骨針形態(tài)的比對(duì)分析表明，它與S.ehrenbergi的骨針形態(tài)一致，而基于msh1基因進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，它與S.ehrenbergi和S.mililatensis2個(gè)種聚為一支，但是基于COI基因進(jìn)化樹能夠明顯將這2種區(qū)分開，除了XM-10外，其他種都與S.ehrenbergi聚為一支.McFadden(2006)通過(guò)分子系統(tǒng)學(xué)發(fā)現(xiàn)以上2種是Sarcophyton和Lobophytum的混合系群，在分子進(jìn)化的角度任然較難區(qū)分[6]，最終通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)果，將Sarcophytonsp.1初步鑒定為S.ehrenbergi.在對(duì)Sarcophytonsp.2骨針形態(tài)進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)其冠部表面骨針和莖的內(nèi)部骨針形態(tài)與Verseveldt報(bào)道的有偏差， Verseveldt也曾發(fā)現(xiàn)以前報(bào)道的S.glaucum莖的內(nèi)部的骨針形狀和尺寸變化很大，導(dǎo)致很多研究者命名為新種[25]，而這些新種其實(shí)同屬于S.glaucum.但是通過(guò)2個(gè)基因進(jìn)化樹分析可以發(fā)現(xiàn)Sarcophytonsp.2與S.glaucum聚為一支，最終我們將此種鑒定為S.glaucum.Sarcophytonsp.4的骨針形態(tài)與S.trocheliophorum種的骨針形態(tài)基本一致，但是在msh1進(jìn)化樹分析時(shí)卻與S.trocheliophorum和S.buitendijki聚為一支，在COI基因進(jìn)化樹中Sarcophytonsp.4也與S.trocheliophorum明顯聚為一支，由于在Genebank中并沒(méi)有S.buitendijki的COI序列數(shù)據(jù)，不能確定與S.buitendijki的進(jìn)化關(guān)系，最終將Sarcophytonsp.4鑒定為S.trocheliophorum.根據(jù)鑒定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，很多形態(tài)學(xué)結(jié)果能夠清晰的將不同種類鑒定，可是還存在很多種類不能夠準(zhǔn)確的區(qū)分，導(dǎo)致比較多的新種的發(fā)現(xiàn)[25]，而通過(guò)DNA條形碼技術(shù)卻能夠?qū)⒛承┤菀谆煜姆N類做出明顯的區(qū)分，所以在肉芝軟珊瑚的鑒定工作中，應(yīng)該以形態(tài)學(xué)為主，分子系統(tǒng)學(xué)為輔助的方法來(lái)進(jìn)行肉芝軟珊瑚多樣性的研究.

3 結(jié)論

本研究首次通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合msh1基因和COI基因序列分析，對(duì)采集于海南省三亞市西瑁島、萬(wàn)寧市甘蔗島和大洲島珊瑚礁區(qū)的26個(gè)肉芝軟珊瑚樣品進(jìn)行種類鑒定，最終將采集到的26個(gè)肉芝軟珊瑚樣品初步鑒定為5個(gè)種，這些種與我國(guó)南海地區(qū)已報(bào)道的肉芝軟珊瑚種類部分吻合(表1)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)在我國(guó)南海的新記錄種SarcophytoncherbonnieriTixier-Durivault, 1958和SarcophytoncrassumTixier-Durivault，豐富了我國(guó)肉芝軟珊瑚的種類.但由于采樣不全面，本研究不能得出這3個(gè)地區(qū)軟珊瑚的完整的分布情況.我國(guó)南海地區(qū)軟珊瑚種類豐富，國(guó)內(nèi)只有在上個(gè)世紀(jì)通過(guò)形態(tài)學(xué)開展過(guò)軟珊瑚的資源調(diào)查[13-14]，而隨著分子生物學(xué)在生物學(xué)各個(gè)方面的應(yīng)用，利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究越來(lái)越廣泛[35]，因此急需進(jìn)一步展開南海其他海區(qū)軟珊瑚種類的鑒定和資源調(diào)查工作，本研究為今后的肉芝軟珊瑚鑒定和生物多樣性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).