孫 婧, 劉 丹, 慧文其

1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院,陜西咸陽 712046;2.西安市第五醫(yī)院, 陜西中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 西安 710082

類風濕性關節(jié)炎是一種免疫系統(tǒng)疾病,其特征是血清尿酸濃度增加[1]。隨著現(xiàn)代計算機技術的發(fā)展與計算分子性質(zhì)方法的開發(fā),讓利用計算機技術來幫助藥物發(fā)現(xiàn)，即計算機輔助藥物設計成為可能[2,3]。 如果目標酶的三維結(jié)構(gòu)受體可以通過X射線晶體學獲得,并優(yōu)先與共結(jié)晶的配體結(jié)合,結(jié)合位點和配體的模式用交互式計算機圖形技術和計算化學直接研究生物大分子——配體復合物是可行的[4]。因此,研究在配體和酶/受體之間的相互作用也是可行的。將新的候選配體“對接”到結(jié)合位點中,以研究該結(jié)構(gòu)是否能夠以最佳方式與受體相互作用, 這個過程被稱為基于結(jié)構(gòu)的配體設計[5～7]。

秋水仙堿(Colchicine,COL)是一種用于治療類風濕性關節(jié)炎的藥物,它能夠阻止白細胞進入受影響的區(qū)域,因此有助于緩解疼痛和壓痛,適用于急性關節(jié)炎。 但是，秋水仙堿會導致嚴重的副作用,包括腹瀉、惡心、抽筋、腹痛和嘔吐等[8～10]。實驗研究近一步證明秋水仙堿還會導致基因突變和復制障礙。因此, 尋找COL對類風濕性關節(jié)炎有效且副作用小的新型衍生分子是治療類風濕性關節(jié)炎新藥開發(fā)的重要途徑之一。本研究運用對接模擬技術設計出秋水仙堿衍生的生物電子等排抑制劑，以期為新藥的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 分子對接模擬

所有的計算都使用Autodock(4.2版本)作為對接工具(8-12);利用PyMOL (pymol.org)、 Chimera (cgl. ucsf. edu/chimera)、 Discovery Studio Visualizer v3.5(Dassault Systèmes BIOVI, San Diego, CA, USA)和Molecular Modelling ProPlus(7.0版; Norgwyn Montgomery Software, Inc., North Wales, PA, USA)實現(xiàn)對接研究中的可視化。

1.2 秋水仙堿受體與秋水仙堿對接

1.2.1晶體結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu),由與綁定配體相關的受體組成,從結(jié)構(gòu)生物信息學蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載。 所有的關于受體結(jié)構(gòu)的主要信息(識別號. 3E22.pdb)均注冊在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中。

1.2.2蛋白質(zhì)加工 下載的受體蛋白顯示了5個鏈,稱為鏈A～E。 5條多肽鏈并無共價相互作用，由于此蛋白質(zhì)的每個單位都不具有酶學性質(zhì)，所以為了方便計算，在不影響結(jié)果的前提下，選擇刪除其中的4個單位，只留下其中的一個作為靶標進行處理。從這5個鏈中選擇鏈B進行實驗,剩下的鏈被刪除。 鏈B的微管蛋白質(zhì)包含COL受體配體,使用Chimera軟件分離。

根據(jù)文獻報道[11]，該蛋白由A～E鏈形成類似常青藤的三維結(jié)構(gòu)，而秋水仙堿與微管蛋白β-2B鏈相互作用，引發(fā)下游信號。其中，β-2B鏈由蛋白結(jié)構(gòu)中的 B鏈和D鏈組成，已報道的蛋白晶體結(jié)構(gòu)顯示秋水仙堿與B鏈結(jié)合。因此，為減少計算量，僅模擬B鏈與配體分子相互作用。

1.2.3配體結(jié)構(gòu) 配體與受體3E22.pdb分離,使用Chimera軟件(14)。 配體通過自動對接程序進入受體。

1.2.4網(wǎng)格框 AutoDock中的活性區(qū)域是通過在活性點附近創(chuàng)建一個網(wǎng)格框來定義的。網(wǎng)格盒在對接過程中起著重要的作用,因為它們被設計用來覆蓋所有在活性區(qū)域內(nèi)存在的氨基酸,這些氨基酸除了在受體中存在外,還是必需的。 網(wǎng)格框工具使用3個拇指輪小部件,這意味著在x、y和z點尺寸可能會改變。網(wǎng)格點之間的間距可以用一個額外的指輪來調(diào)整。 在本文的研究中,網(wǎng)格點之間的間距固定為0.408 ?,被考慮的點數(shù)分別為x、y和z維度上40、48和50點,x、y和z中心分別為258.798、7.947和28.673。

通過采用以下方法對分子對接的抑制常數(shù)Ki進行計算,得到分子對接模擬技術的結(jié)果：

Log Ki =ΔG/RT×1/2.303

Ki = e,

ΔG/RT,

Ki = antilog ΔG/1362.97988

其中，G=結(jié)合能; R=1.986 kmol; T=298K。

1.2.5齒向修形 已知的微管蛋白抑制劑COL被替換為不同位點的生物等甾醇, 以提高藥效和藥物的相似性, 并減少毒性和相關副作用。

1.2.6毒性、吸收、分布、代謝和排泄毒性(ADME-T)研究 修飾后的分子(organic-chemistry.org/prog/peo)使用在線程序OSIRIS分析,預測任何有毒基團或具有ADME-T活性的分子。

2 結(jié)果與分析

2.1 對接

所有的分子都被檢出,所有的對接研究都通過檢查化學相似性、校準和結(jié)合能(表1)進行了驗證。COL受體配體在受體內(nèi)被識別。圖1顯示了覆蓋微管蛋白受體所有結(jié)合殘基的網(wǎng)格框，并給出了所下載的蛋白質(zhì)與COL受體配體的所有鏈。

2.2 驗證對接過程

為了驗證對接某一特定配體與某一特定大分子的對接過程,本研究考慮了三個參數(shù)：①結(jié)合能。鏈接對接配體的結(jié)合能在5～15 kcal/mol之間。②疊加。配體的對接構(gòu)象與被下載的蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)疊加。成功地完成了與COL(已經(jīng)存在于受體內(nèi))的Autodock對接算法的測試,并與COL的參考結(jié)構(gòu)(即其晶體結(jié)構(gòu))進行了對接。圖2D為COL生物活性構(gòu)象疊加的對接構(gòu)象。為了改進結(jié)果,成功地實現(xiàn)了COL的重新對接。③交互。與蛋白質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)中存在的相互作用相比,對接時必須觀察到對接的配體與受體之間一致的相互作用。在本研究中觀察到的COL結(jié)合配體與在微管蛋白受體中存在的結(jié)合殘基之間的互作如圖2E所示。在受體3E22中,ALA15(丙氨酸-15)和ASN228(天門冬酰胺-228)中,所有配體的鍵都保持彈性。 ALA15和ASN228的所有鍵都是可旋轉(zhuǎn)的。

圖1 蛋白質(zhì)與COL受體配體的所有鏈Fig.1 All the chains of protein and COL receptor ligands.

化合物結(jié)構(gòu)親和力(μmol/L)鍵能 (kcal/mol)Colchicine5.957.13COL_110.946.77COL_29.186.87COL_313.186.66COL_469.295.67COL_520.196.4

圖2 秋水仙堿及其衍生物與3E22蛋白B鏈相互作用關系圖Fig.2 Diagram of interaction of Colchicine and its modified derivative with 3E22 protein B chain.A.秋水仙堿與3E22蛋白B鏈相互作用；B.設計化合物COL_1與3E22蛋白B鏈相互作用；C.設計化合物COL_2與3E22蛋白B鏈相互作用；D.設計化合物COL_3與3E22蛋白B鏈相互作用；E.設計化合物COL_4與3E22蛋白B鏈相互作用；F.設計化合物COL_5與3E22蛋白B鏈相互作用。

2.3 毒性和ADME-T研究

本研究中的毒性和ADME-T分析結(jié)果顯示在表2中。結(jié)果表明,所有4個基于秋水仙堿的微管蛋白抑制劑沒有任何主要的毒性效應,包括致突變性、致瘤性、刺激性以及生殖效應,因為在線程序OSIRIS (Molecular Property Explorer)沒有確定在設計的分子內(nèi)存在負責這些毒性作用的任何有毒官能團。所有的分子都具有良好的藥代動力學,并嚴格按照Lipinski的五(18)法則對其理化性質(zhì)進行篩選。

2.4 COL系列化合物對接模式研究

設計的系列化合物COL_1-5分別與微管蛋白對接，研究其結(jié)合模式。化合物COL_1苯環(huán)結(jié)構(gòu)上的甲氧基與Lys352之間形成氫鍵，結(jié)合方式不同于秋水仙堿，預測活性較差。COL_2酰胺結(jié)構(gòu)上的羰基與Thr353之間形成氫鍵，苯環(huán)結(jié)構(gòu)橫亙于β片層和α螺旋之間，存在空間沖突，預測活性不高。COL_3分別與Asn349和Asn258形成氫鍵，作用較為牢固，疏水的苯環(huán)插入β片層和α螺旋之間，預測活性較佳。COL_4作用方式不同于秋水仙堿，酰胺取代的苯環(huán)插入蛋白內(nèi)部，而三取代的苯環(huán)暴露于蛋白外部，同Asn258和Lys352形成氫鍵，預測活性最佳，但仍需進一步的實驗驗證。COL_5作用方式類似于COL_4，酰胺結(jié)構(gòu)位于蛋白內(nèi)部，三取代的苯環(huán)位于蛋白外部，同Asn349形成氫鍵，預測活性也較好。

表2 秋水仙堿及其衍生物的吸收、分布、代謝和排泄毒性分析及毒性預測Table 2 Absorption, distribution, metabolism and excretion toxicity profiling and toxicity prediction of Colchicine and the modified Colchicine derivative.

3 討論

結(jié)合已經(jīng)報道的秋水仙堿與微管蛋白結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，可以看到微管蛋白上的Asn258與秋水仙堿環(huán)上的羰基之間有氫鍵相互作用，疏水的苯并七元環(huán)插入由β片層和α螺旋形成的空腔中。文中設計的系列化合物COL_1～5分別與微管蛋白對接，其中COL-3與COL-4均與Asn258有相互作用，與已經(jīng)報道的文獻較為符合，同時考慮到COL-4對接分數(shù)最高，與蛋白結(jié)合穩(wěn)定，預測活性較好，有可能成為新型的微管蛋白電子等排抑制劑，但仍需進一步的生物活性測試。

本研究結(jié)果表明，新型秋水仙堿類人腎小管蛋白抑制劑可能是治療關節(jié)炎的有效藥物。從抑制常數(shù)Ki值可以看出，所設計的抑制劑均與大分子表現(xiàn)出良好的結(jié)合力。所有設計的抑制劑的毒性和ADME-T分析證實了沒有任何毒性官能團。所有的抑制劑都是按照Lippinski’s Rule of Five(18)設計的，因此，所有的抑制劑都表現(xiàn)出與藥物相似的作用。與COL相比，所有設計的COL衍生物表現(xiàn)出更強的結(jié)合力，此外，與母體分子COL相比，其物理化學性質(zhì)也有所改善。