葛婷婷, 高 瑜, 鄭大恒, 鄭盼幸, 孫 倩, 麻閏堯, 李秋霞, 韓繼衛(wèi)

紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 紹興 312000

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄購于東莞市巴科醫(yī)藥科技有限公司；酒曲購于雅大釀酒設(shè)備酒曲廠；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)購于美國Sigma-Aldrich公司；鄰苯三酚、水楊酸、ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)、沒食子酸、蘆丁購于Macklin有限公司；其他試劑均為分析純試劑，購于國藥集團。

1.2 方法

1.2.1玫瑰茄米酒的釀造 取玫瑰茄干花萼，磨粉備用。另取優(yōu)質(zhì)糯米500 g，清洗浸泡后蒸煮，煮飯結(jié)束后攤飯冷卻，待米飯不燙手時拌曲5 g落缸，壓實并搭窩，72 h后加水600 mL封壇。采用同樣方法一共釀制9壇米酒，隨機選取3壇米酒，每壇在拌曲的同時加入玫瑰茄花萼粉5 g共同糖化發(fā)酵，此酒命名為前加酒。另取3壇米酒在拌曲72 h后，取5 g玫瑰茄粉進行煮汁，濃縮至50 mL后與550 mL水混勻加入酒壇發(fā)酵，此酒命名為后加酒。同時設(shè)空白對照酒3壇，發(fā)酵30 d從每個酒壇中取適當(dāng)?shù)木茦与x心，取上清液用于后續(xù)的實驗。

1.2.2玫瑰茄米酒品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的測定 玫瑰茄米酒酒精度、總糖、總酸和氨基酸態(tài)氮的測定參照GB/T 13662-2008[11]；揮發(fā)酯的測定參照王福榮[12]的方法；總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法[13]，結(jié)果以沒食子酸的相當(dāng)量表示，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.034 4x+0.0968(R2=0.993 6)，玫瑰茄酒中總酚含量按照以下公式計算：吸光度值A(chǔ)=0.034 4×總酚含量+0.096 8；總黃酮的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[14]，結(jié)果以蘆丁的相當(dāng)量表示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.461 2x+0.001 6(R2=0.997 7)，玫瑰茄酒中總黃酮含量按照以下公式計算：吸光度值A(chǔ)=0.461 2×總黃酮含量+0.001 6。

1.2.3玫瑰茄米酒的感官評價 隨機選取10名(5男5女)食品專業(yè)學(xué)生組成感官分析小組。參照糯米酒的評價指標(biāo)，同時參照洪璇等[15]的方法，從色澤、澄清度、香氣、口味四個方面進行感官評分，感官質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)進行評判，滿分100，結(jié)果取平均值。

表1 玫瑰茄米酒感官質(zhì)量評價表Table 1 Evaluation standard of sensory quality of the rice wine adding H. sabdariffa.

1.2.4玫瑰茄米酒抗氧化活性的測定 ①DPPH自由基清除能力的測定。DPPH自由基在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有最大吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色。當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH自由基的單電子被捕捉而使其顏色變淺，其褪色程度與自由基清除劑效率呈線性關(guān)系，因而可用比色法進行定量分析來檢測自由基的清除情況，從而評價樣品的抗氧化能力[16]。

精確吸取2 mL酒樣，然后加入2 mL 0.1 mol/L的DPPH無水乙醇溶液，搖勻后避光靜置于40℃的恒溫水浴鍋中30 min，在波長為517 nm處測定樣品吸光度[17]。自由基清除率公式：

堤防工程中首先要進行地基鋪填，碾壓好的合成土料鋪在第一層，然后分段之后在地基上鋪一層土料，碾壓一層鋪一層，層層鋪填層層碾壓，鋪填好地基之后還要對側(cè)面進行防水防滲處理，構(gòu)筑混凝土防滲墻，注意地基鋪填的寬度、厚度都要滿足施工要求。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式中，A0：不加樣品的吸光度；A1：加樣品的吸光度；A2：不加DPPH樣品的吸光度。

②羥基自由基清除能力的測定。羥基自由基是目前所知活性氧自由基中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，它可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成生命必需物質(zhì)如核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類和脂類的氧化損傷，使細胞突變或壞死，羥基自由基還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬等有關(guān)[18]。因此，清除體內(nèi)羥基自由基是保證人體健康必不可少的要求。

精確吸取9 mmol/L硫酸亞鐵1 mL，加入1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，然后加入酒樣1 mL，最后加入8.8 mmol/L的H2O21 mL，搖勻后在37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，用蒸餾水作參比，在波長510 nm下測定吸光度值，同時做空白和陽性對照[19]。自由清除率公式：

羥基自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

式中，A0：不加樣品的吸光度；A1：加樣品的吸光度；A2：不加H2O2樣品的吸光度。

③ABTS+·自由基的清除能力的測定。ABTS+·自由基是人工合成的自由基，常用來體外評價物質(zhì)的抗氧化活性[20]。

配制ABTS+·儲備液：稱取過硫酸鉀配制成2.45 nmol/L過硫酸鉀溶液，然后用過硫酸鉀溶液溶解ABTS，制成7 mmol/L的ABTS+·儲備液，儲備液在室溫、避光的條件下靜置12～16 h，這種儲備液可以穩(wěn)定3～4 d。

配制ABTS+·測定液：用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.4)稀釋ABTS+·儲備液，讓測定液的吸光度在波長為734 nm處達到0.700。

測定吸光度：取出4 mL的ABTS+·測定液，加入40 μL的待測酒樣，振蕩30 s后，反應(yīng)一定時間，于波長734 nm處測定吸光度[21]。

ABTS+·清除率(%)=(1-A樣品/0.700)×100%。

1.2.5統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析，試驗重復(fù)3次，結(jié)果用 Mean±SD 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1影響玫瑰茄米酒品質(zhì)的相關(guān)指標(biāo)含量分析由表2可知：兩種釀制工藝釀造的玫瑰茄米酒，對于酒精度，前加酒的酒精度最高，為15.67%±0.63%，其次為后加酒，酒精度為14.83%±1.38%，與空白酒相比，差異顯著(P<0.05)；對于總糖含量，前加酒、后加酒中的糖含量均高于空白酒(P<0.05)，且后加酒中糖含量最高，為(14.90±0.40)g/L，與空白酒相比差異極顯著(P<0.01)；對于總酸含量，前加酒、后加酒與空白酒相比，差異不顯著(P>0.05)，但后加酒中的總酸含量最低，為(5.99±0.52)g/L。

對于氨基酸態(tài)氮，后加酒中的氨基酸態(tài)氮為(0.59±0.04)g/L，與空白酒相比，差異顯著(P<0.05)，同時后加酒中的揮發(fā)酯也顯著高于空白酒(P<0.01)，為(0.42±0.03)g/L。

表2 玫瑰茄米酒品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的含量Table 2 Content of quality index related to the rice wine adding H. sabdariffa.

注：*和**表示與同行的空白酒對照相比在P<0.05 和P<0.01水平上差異顯著。

由于玫瑰茄中含有多酚和黃酮類活性成分，為了研究玫瑰茄的添加是否會擴大酒的功效，我們對兩種工藝釀制的玫瑰茄米酒中總多酚和總黃酮的含量進行了測定，由表2可知：與空白酒相比，無論是前加酒還是后加酒，總多酚含量均顯著高于空白酒(P<0.05，P<0.01)；總黃酮含量極顯著高于空白酒(P<0.01)。

根據(jù)感官評價指標(biāo)，對玫瑰茄米酒進行感官評價發(fā)現(xiàn)：加入玫瑰茄后酒色澤均一，呈琥珀色，清澈透亮，口感柔和；其中后加酒的色澤更為均勻濃厚，香氣濃郁，柔和爽口，具有糯米酒品種的典型風(fēng)格。

2.2DPPH自由基清除能力測定

由圖1可知，3種酒對DPPH自由基均有清除作用，具有抗氧化活性。前加酒對DPPH自由基的清除率為91.33%±2.08%，后加酒對DPPH自由基的清除率為91.57%±2.72%，與空白對照酒相比，存在顯著性差異(P<0.05)。研究表明玫瑰茄具有良好的抗氧化活性[22～24]，加入酒中尤其是煎汁后在后發(fā)酵時加入，能顯著提高酒液對DPPH自由基的清除效率，提高酒液的抗氧化活性。同時研究結(jié)果顯示，未加玫瑰茄的空白對照酒，也具有抗氧化活性，對DPPH自由基的清除率為70.97%±2.94%，推測糯米在發(fā)酵的過程中，產(chǎn)生有機物質(zhì)，如酚酸等，使得米酒本身也具有一定的抗氧化活性。

圖1 玫瑰茄米酒對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of the rice wine adding H. sabdariffa on DPPH free radical.注：**表示與空白對照組相比在P<0.01水平上差異顯著。

2.3羥自由基的清除能力測定

由圖2可知，兩種釀造工藝釀制的玫瑰茄米酒，前加酒對羥自由基的清除率為80.30%±3.12%，后加酒對羥自由基的清除率為86.47%±4.19%，兩種工藝釀制的玫瑰茄米酒對羥自由基清除能力均比空白酒強，且后加酒對羥自由基清除能力更好，與空白酒有顯著性差異(P<0.05)。研究結(jié)果表明，米酒中添加了具有抗氧化活性的藥食同源物質(zhì)，能夠提升米酒對羥基自由基的抗氧化活性。

圖2 玫瑰茄米酒對羥自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of the rice wine adding H. sabdariffa on ·OH free radical.注：**表示與空白對照組相比在P<0.01水平上差異顯著。

2.4ABTS+·自由基的清除能力測定

由圖3可知，前加酒對ABTS+·自由基的清除率為39.20%±4.07%，后加酒對ABTS+·自由基的清除率為48.77%±3.87%，空白酒對ABTS+·自由基的清除率為25.93%±5.75%，不同釀造工藝釀制的玫瑰茄米酒，對ABTS+·自由基的清除率均高于空白對照酒，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明：玫瑰茄的添加有利于提高米酒對ABTS+·自由基的抗氧化活性。

3 討論

本研究對兩種工藝釀造玫瑰茄米酒的酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)酯、總多酚及總黃酮含量進行了檢測。酒精度、總糖和總酸是決定成品酒品質(zhì)最基本的三個理化指標(biāo)。兩種釀制工藝釀造的玫瑰茄米酒其酒精度與空白酒相比都有顯著提高，這說明玫瑰茄的加入，可能會改變米酒發(fā)酵的微生態(tài)環(huán)境，有利于微生物的活化從而使發(fā)酵更為全面。酒中總糖含量對酒的風(fēng)味調(diào)節(jié)有很重要的作用，糖可以使酒口感更為柔和、流暢、飽滿。本研究發(fā)現(xiàn)后加酒中含糖量最高，達到(14.90±0.40)g/L，前加酒的含糖量次之，為(12.95±0.25)g/L，兩者都高于空白酒中的含糖量，與空白酒比較呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。這說明前加酒和后加酒在口感、柔和程度上會高于空白酒。對于酸度，酒中適宜的酸度可刺激味蕾增加酒的口感，但過量的酸度會影響酒的品質(zhì)。由表2可以看出，三種酒在酸度上不存在統(tǒng)計學(xué)上的差異，但后加酒的酸度相對較低，這說明后加酒較為爽口，刺激性較低。酒的口感好壞很大程度上取決于氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)酯，研究表明氨基酸態(tài)氮的含量越高酒的口感越好，酒中揮發(fā)酯含量越高酒的香氣越足。本研究釀制的玫瑰茄米酒后加酒中氨基酸態(tài)氮含量最高，為(0.59±0.04)g/L，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13662-2008中傳統(tǒng)型干黃酒的氨基酸態(tài)氮含量，本研究釀造的玫瑰茄米酒氨基酸態(tài)氮含量屬于優(yōu)級。同時該酒中揮發(fā)酯的含量也最高，為(0.42±0.03)g/L，極顯著高于空白酒(P<0.01)，這說明后加酒中風(fēng)味物質(zhì)最多，香氣最足。感官評價也發(fā)現(xiàn)后加酒的色澤均勻、透亮，香氣純正，口感協(xié)調(diào)、綿柔?？傊谔腔蠹尤朊倒迩阎尼勗旃に囜勗斓拿倒迩丫瓶诟凶罴?，并且酒精度、總糖及總酸適宜，酒中氨基酸態(tài)氮及揮發(fā)酯的含量最高，綜合以上結(jié)果說明后加酒的品質(zhì)要好于前加酒以及空白酒，糖化后加入玫瑰茄汁的釀造工藝更適合釀造玫瑰茄酒。

圖3 玫瑰茄米酒對ABTS+·自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of the rice wine adding H. sabdariffa on ABTS+· free radical.注：*和**表示與空白對照組相比在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

玫瑰茄中含有多酚和黃酮這兩類物質(zhì)，多酚和黃酮是已知的抗氧化物質(zhì)[25]，本研究對玫瑰茄米酒中總多酚和總黃酮的含量也進行了測定。研究表明，后加酒總多酚含量為(207.90±6.97)mg GAC /L，前加酒總多酚含量為(192.67±4.41)mg GAC /L，與空白酒相比，無論是前加酒還是后加酒，總多酚含量均顯著高于空白酒(P<0.05，P<0.01)。同時前加酒與后加酒中總黃酮含量均高于空白酒，且后加酒中的總黃酮含量最高，為(61.57±0.84)mg Ru/L，與空白酒存在著極顯著差異(P<0.01)。玫瑰茄米酒中總多酚與總黃酮含量高，說明玫瑰茄米酒具有良好的抗氧化活性。

添加玫瑰茄后釀制的米酒，無論是對DPPH自由基的清除率，還是對羥自由基、ABTS+·自由基的清除率都高于未添加玫瑰茄的空白酒，與空白酒存在顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，因此玫瑰茄米酒具有較好的抗氧化活性，可以作為一種保健酒來飲用。