趙清輝, 琚芳迪, 蘇澤華, 羅秋麗, 儀 楊, 張曉康, 張 鑫, 謝 飛, 馬雪梅

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 北京 100124

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重問題。每年，全世界大約有1 000萬人遭受創(chuàng)傷性腦損傷，并且相當(dāng)多的患者會(huì)因此暫時(shí)或永久殘疾、甚至死亡。有研究預(yù)測(cè)，到2020年，TBI將成為全球負(fù)擔(dān)最重的第三大疾病[1～5]。此外，TBI被證實(shí)與癲癇、阿爾茲海默病、帕金森病、慢性神經(jīng)炎等疾病密切相關(guān)[6～9]。為了尋找合理的TBI治療方案，研究人員建立了許多體內(nèi)動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型，用于研究TBI的病理生理機(jī)制。鑒于臨床上TBI發(fā)生情況各異，研究人員建立了不同類別的動(dòng)物模型來復(fù)制不同類型的創(chuàng)傷性腦損傷，雖然較大的動(dòng)物在尺寸上和生理上與人類更為接近，但由于嚙齒類動(dòng)物具有體積小、成本低、容易量化等特點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于TBI動(dòng)物模型的建立[10,11]。早期的TBI動(dòng)物模型主要模擬了腦損傷的生物力學(xué)變化，近年來創(chuàng)建的動(dòng)物模型還可用于研究由頭部創(chuàng)傷引發(fā)的分子相互作用機(jī)制以及分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11,12]。同樣的，體外TBI模型也是研究TBI病理生理機(jī)制的重要工具，其優(yōu)勢(shì)在于能夠減少體內(nèi)復(fù)雜因素的干擾，從而更準(zhǔn)確地反映由機(jī)械損傷引起的細(xì)胞、組織的生物學(xué)變化。此外，與體內(nèi)模型相比，體外模型具有重復(fù)性好、可控性好、實(shí)驗(yàn)成本較低、倫理問題較少等優(yōu)勢(shì)。根據(jù)致傷方式的不同，常用的TBI模型可分為機(jī)械作用力損傷模型、壓力損傷模型、爆炸傷模型、反復(fù)性輕度損傷模型。本文對(duì)上述常用模型進(jìn)行了綜述和比較分析，以期為尋找在臨床上具有神經(jīng)保護(hù)效果的治療方案提供幫助。

1 機(jī)械作用力損傷模型

1.1 機(jī)械作用力損傷TBI動(dòng)物模型

機(jī)械作用力損傷TBI動(dòng)物模型常用的有自由落體打擊(weight-drop，WD)模型和控制性皮層沖擊損傷(controlled cortical impact，CCI)模型。

WD是一種常用的造模方法，通過重物自由下落打擊硬腦膜或者顱骨造成腦損傷，通常采用一根導(dǎo)管來引導(dǎo)重物自由下落，通過重物的重量和下落的高度來控制損傷程度[10,11,13]。Feeney WD模型是通過直接打擊硬腦膜造成腦皮質(zhì)挫傷，并通過調(diào)節(jié)撞擊頭的重量和自由下落的高度來建立輕度、中度、重度腦損傷模型，主要用于模擬腦震蕩和腦挫裂傷[14～18]。Marmarou WD模型在Feeney模型的基礎(chǔ)上做了2個(gè)方面的改進(jìn)：①將麻醉大鼠固定在海綿平臺(tái)上，既可確保外力的瞬時(shí)性，也可在打擊后通過抽出海綿平臺(tái)，避免二次打擊；②在頂部正中放置1個(gè)直徑1 cm、厚0.3 cm的金屬片以確保外力作用的彌散性，主要用于模擬彌漫性腦損傷。此模型的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單、條件易于控制等；缺點(diǎn)是致死率較高。

CCI模型是通過高速運(yùn)動(dòng)的空氣所產(chǎn)生的沖擊力帶動(dòng)金屬撞擊頭直接打擊暴露的硬腦膜，造成一定程度的腦損傷。其主要用于復(fù)制TBI后皮質(zhì)組織缺失、急性硬膜下血腫、軸索損傷、腦震蕩、血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)功能障礙甚至昏迷等癥狀。該模型可以通過調(diào)節(jié)撞擊停留時(shí)間、撞擊速度、打擊深度來控制損傷程度[19～21]。與Marmarou WD模型相比，CCI模型改善了機(jī)械因素，極大降低了模型致死率；還可通過腦立體定位儀對(duì)顱腦打擊位置精準(zhǔn)定位，打擊力度更為精確；同時(shí)，撞擊后，撞擊頭自動(dòng)迅速回收，避免了因擠壓造成的損傷或因重物反彈造成的二次損傷[11,22,23]?？傊珻CI模型致傷準(zhǔn)確、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，使TBI生物力學(xué)的研究更為有效。

1.2 機(jī)械作用力損傷TBI細(xì)胞模型

機(jī)械作用力損傷TBI細(xì)胞模型主要包括機(jī)械橫斷體外細(xì)胞模型(cell transection injury)和牽張損傷體外細(xì)胞模型(cell stretch injury)。

機(jī)械橫斷體外細(xì)胞模型是采用塑料細(xì)針、刀片或激光將附著在培養(yǎng)皿上的神經(jīng)細(xì)胞突起與胞體離斷，用于模擬穿刺傷、穿透性顱骨骨折以及TBI后各種腦組織病變。Faden等[24]采用1個(gè)由28個(gè)不銹鋼葉片連接的沖擊裝置，對(duì)培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)械損傷，切割裝置在96孔組織培養(yǎng)板的細(xì)胞層中做均勻切割，間距為1.2 mm；24 h后通過檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放量來測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，切割裝置直接導(dǎo)致葉片下的細(xì)胞死亡，24 h內(nèi)，傷口周圍的神經(jīng)細(xì)胞逐漸死亡。隨后，研究人員對(duì)模型進(jìn)行改進(jìn)，直接省去沖擊裝置，采用更為簡(jiǎn)單的黃色槍頭(直徑1.5 mm)和白色槍頭(直徑1 mm)機(jī)械性劃割培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞，根據(jù)劃傷面積的不同來建立不同程度的損傷模型[25,26]。該模型無需特殊設(shè)備條件，操作簡(jiǎn)便，是一種簡(jiǎn)單有效的體外模型；而其不足是機(jī)械損傷參數(shù)無嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，損傷嚴(yán)重程度僅以損傷細(xì)胞數(shù)目分級(jí)。

牽張損傷體外細(xì)胞模型是通過改變細(xì)胞形態(tài)造成細(xì)胞不同程度的伸展?fàn)繌垼康闹饕菫榱搜芯縏BI的生物力學(xué)效應(yīng)。其中應(yīng)用較為廣泛的模型是通過壓縮氣體使夾持的圓形板變形，圓形板上貼壁的神經(jīng)細(xì)胞也隨之變形，根據(jù)施加的壓力大小不同造成輕度、中度和重度損傷[27～29]。此模型的缺點(diǎn)：在較高的變形速率下，圓形板易造成不均勻變形；由于細(xì)胞需粘附在基材上，細(xì)胞的粘附性形變的驗(yàn)證就十分重要。

另一種得到廣泛應(yīng)用的是采用微流體裝置建立模型，通過向柔性聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜下方的氣動(dòng)通道施加氣體壓力，造成PDMS膜形變進(jìn)而引起軸突拉伸損傷[30]。采用微流體裝置模型的優(yōu)勢(shì)是可以檢測(cè)損傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞特定部分的影響，即可對(duì)神經(jīng)細(xì)胞特定的區(qū)域(如胞體、軸突)進(jìn)行精確損傷；而其不足之處是需要笨重的氣動(dòng)裝置，設(shè)備儀器較為復(fù)雜[31]。

2 壓力損傷模型

2.1 壓力操作TBI動(dòng)物模型

壓力損傷TBI動(dòng)物模型主要包括液壓沖擊傷(fluid percussion injury，F(xiàn)PI)模型和穿透性腦損傷(penetrating ballistic-like brain injury，PBBI)模型。

FPI模型是通過向顱腔內(nèi)快速注入一定量的生理鹽水造成腦組織的變形和移位，從而導(dǎo)致腦損傷，損傷程度取決于壓力脈沖的強(qiáng)度。FPI模型可以復(fù)制人類TBI后顱內(nèi)出血、腦腫脹和漸進(jìn)性灰質(zhì)損害等病理生理特點(diǎn)，主要用于復(fù)制臨床無顱骨骨折的TBI[32～37]。根據(jù)顱骨鉆孔位置的不同，F(xiàn)PI模型可以分為中央(矢狀縫上)FPI模型、矢狀竇旁(距中線<3.5 mm)FPI模型和側(cè)方(距中線>3.5 mm)FPI(lateral fluid percussion injury，LFPI)模型。早期的FPI模型主要是通過控制鐘擺下落的高度這一單一變量來控制損傷程度。為了提高可重復(fù)性，Kabadi等[38]開發(fā)了一種微處理器控制的氣動(dòng)裝置，采用這種新型設(shè)備，沖擊壓力和停留時(shí)間均可得到精確控制以減少試驗(yàn)之間的差異。LFPI模型產(chǎn)生的認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)行為障礙等是臨床上TBI患者常見的癥狀。但是由于造成腦干損傷，呼吸暫停時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)PI模型與其他模型相比具有較高的致死率。因此，大鼠LFPI模型中開顱手術(shù)部位的選擇確定對(duì)損傷程度至關(guān)重要，建模時(shí)要精確控制開顱手術(shù)的位置，以提高模型的可靠性和重復(fù)性。

另一種模擬顱內(nèi)壓升高的模型是PBBI模型，其由高能量彈頭和沖擊波造成，這種沖擊波在大腦中產(chǎn)生了數(shù)倍于彈丸本身尺寸的臨時(shí)腔，而其損傷程度取決于彈射的路徑和能量轉(zhuǎn)移的程度。目前，已開發(fā)出多種新的PBBI嚙齒動(dòng)物模型。Davis等[39]將PBBI探針經(jīng)由骨窗進(jìn)入大腦右半球，進(jìn)針深度為1.2 cm，由計(jì)算機(jī)程序控制，向探針內(nèi)充水，使探針彈性頭膨脹，產(chǎn)生1個(gè)橢圓形的水球，體積等于大腦體積的10%，球囊放水后，探頭縮回，從而建立PBBI模型。大鼠PBBI模型會(huì)造成白質(zhì)和灰質(zhì)損傷、腦水腫、癲癇、皮層擴(kuò)散、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)炎癥等，還會(huì)體現(xiàn)出由此造成的感覺障礙以及認(rèn)知功能障礙的癥狀。與其他TBI模型相比，由于PBBI模型損傷的滲透性及其形成的暫時(shí)性腔，其在整個(gè)原發(fā)病灶中會(huì)引起廣泛的腦內(nèi)出血[11,40]。正是PBBI模型所具有的特點(diǎn)，使其對(duì)研究中度或重度顱腦損傷的機(jī)制具有重要意義。

2.2 壓力損傷TBI細(xì)胞模型

壓力損傷TBI細(xì)胞模型包括加壓損傷(compression injury)神經(jīng)細(xì)胞模型和負(fù)壓引流損傷(vacuum assisted injury)神經(jīng)細(xì)胞模型。

加壓損傷神經(jīng)細(xì)胞模型即通過向體外培養(yǎng)的細(xì)胞施加一定的壓力從而造成細(xì)胞損傷，主要用于復(fù)制閉合性腦損傷或FPI模型。但為了獲得細(xì)胞反應(yīng)，增加的壓力需遠(yuǎn)超過TBI期間發(fā)生的水平。在培養(yǎng)基產(chǎn)生的靜水壓力條件下，腦部變形可能非常小，因?yàn)槟X組織幾乎是不可壓縮的，因此，需要更高的壓力(15個(gè)大氣壓左右)才能造成損傷。陳翰博[41]將星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)盒與加壓器連接并密封，注入氮氧混合氣體，分別給予不同大小的壓力，結(jié)果顯示加壓后細(xì)胞體積增大、水腫明顯，且隨著壓力的增加，水腫更為明顯。加壓損傷模型與TBI后臨床病理生理相似，且方法簡(jiǎn)單、條件易于控制，可通過調(diào)整壓力值來控制損傷程度，主要用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中神經(jīng)細(xì)胞機(jī)械性損傷的研究，也適用于TBI后各神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性損傷的研究[42～44]。

負(fù)壓引流損傷神經(jīng)細(xì)胞模型是通過使用微流控裝置和實(shí)驗(yàn)室真空來損傷軸突。一旦軸突生長(zhǎng)至相鄰隔室，采用巴斯德吸管在第二隔室入口真空抽吸，在第二隔室產(chǎn)生一個(gè)氣泡，此氣泡會(huì)對(duì)第二隔室的軸突產(chǎn)生剪切力，造成軸突損傷。因此，該裝置會(huì)導(dǎo)致軸突損傷且不影響胞體，這種損傷方法隨后被用于篩選潛在的軸突再生的治療?；谖⒘黧w和真空的損傷機(jī)制也可用于模擬和表征急性軸索變性(acute axonal degeneration，AAD)[31]。Zhou等[45]使用微流體真空吸入損傷模型來研究損傷后觀察到的成熟軸突再生減少的途徑。在成熟軸突中，線粒體錨定蛋白(mitochondria-anchoring protein syntaphilin)SNPH阻礙線粒體運(yùn)輸，從而在損傷部位產(chǎn)生能量缺陷。通過敲除SNPH基因增強(qiáng)線粒體運(yùn)輸，通過增加線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)和維持受損軸突的ATP供應(yīng)促進(jìn)了損傷后的軸突再生。因此，真空吸入損傷模型可以表征線粒體運(yùn)輸以及受損軸突的能量供應(yīng)，并且能夠?yàn)檩S突再生提供新的治療策略[31]。此模型的不足之處在于需要互相連接的隔室之間的高流體阻力以限制對(duì)特定神經(jīng)元區(qū)域的傷害。該阻力通常由微流體裝置中的微槽提供，因此，必須仔細(xì)調(diào)整真空的持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度以減少對(duì)非特定區(qū)域的損害。

3 爆炸傷模型

顱腦爆炸傷主要指的是由爆炸沖擊波和投射物造成的顱腦損傷(blast-induced traumatic brain injury，bTBI)，是現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)中的主要傷型。國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)bTBI建立了各種各樣的模型，其中常用的有自由場(chǎng)爆炸模型、爆炸管模型、小型爆炸源模型、以及高級(jí)爆炸模擬器(advanced blast simulator，ABS)模型[46～49]。ABS模型無需使用炸藥，而是以壓縮氣體作為動(dòng)力。其結(jié)構(gòu)為一圓柱形管，中間采用一種特殊材質(zhì)的薄膜將圓柱形管分割為2個(gè)室，分別為加壓區(qū)和測(cè)試區(qū)，當(dāng)加壓區(qū)氣壓上升到一定程度擊破隔膜所產(chǎn)生的沖擊波，會(huì)對(duì)放置于測(cè)試區(qū)的動(dòng)物頭部造成損傷。Rodriguez等[49]采用的激波管待測(cè)區(qū)長(zhǎng)度為2 m、加壓區(qū)長(zhǎng)度為2.54 m、隔膜厚度為0.4 mm，將大鼠頭部放于激波管待測(cè)區(qū)，通過將空氣加壓至1 230 kPa左右沖破隔膜產(chǎn)生沖擊波，造成大鼠頭部損傷，從而建立bTBI動(dòng)物模型。ABS模型是目前bTBI研究領(lǐng)域中應(yīng)用最多的模型，其優(yōu)點(diǎn)主要是安全性高、可在室內(nèi)操作，從而降低了外界的干擾；且可通過調(diào)節(jié)隔膜的材料，產(chǎn)生不同大小的沖擊波[36,50～52]。但需要注意的是，ABS模型也有其自身的重要缺點(diǎn)：①氣體驅(qū)動(dòng)沖擊波的物理特性可能不同于爆炸沖擊波；②隔膜碎片可能對(duì)受試對(duì)象產(chǎn)生影響；③管出口附近產(chǎn)生的射流效應(yīng)可能對(duì)受試對(duì)象產(chǎn)生影響[46]。

同樣的，將培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞以及腦組織切片放在激波管待測(cè)區(qū)，則可建立bTBI體外模型。Campos-Pires等[53]將小鼠海馬腦片細(xì)胞面向激波管，分別采用不同沖擊壓力來建立創(chuàng)傷模型，并利用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法檢測(cè)細(xì)胞死亡水平。結(jié)果表明，爆炸傷的損傷程度隨沖擊壓峰值和沖擊波的增加而增加，且沖擊波誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式主要是細(xì)胞凋亡。

4 反復(fù)性輕度損傷模型

反復(fù)性輕度創(chuàng)傷性腦損傷(repeated mild traumatic brain injury)模型通常發(fā)生在需接觸的運(yùn)動(dòng)(拳擊、籃球、足球、橄欖球)及家暴等情況中[11,54]。越來越多的證據(jù)表明，反復(fù)腦震蕩會(huì)導(dǎo)致行為異常和病理改變。目前已建立了多種反復(fù)性輕度創(chuàng)傷性腦損傷模型，如CCI模型、WD模型、FPI模型、Blast-TBI模型、cell stretch injury 模型[37,55～58]。研究表明，短時(shí)間內(nèi)反復(fù)輕度TBI可以造成彌漫性軸索損傷和慢性神經(jīng)炎，而這些病理生理現(xiàn)象與阿爾茲海默病、帕金森綜合癥等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。由于輕度腦損傷往往被人們忽略，但反復(fù)性輕度創(chuàng)傷性腦損傷可能是災(zāi)難性或致命性的，因此，反復(fù)性輕度創(chuàng)傷性腦損傷模型對(duì)TBI后神經(jīng)退行性疾病的研究具有重要意義。

綜上所述，TBI模型的建立為研究相關(guān)發(fā)病機(jī)制、開發(fā)有效治療方案奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)將各模型的特點(diǎn)做一總結(jié)，具體見表1。

5 展望

盡管利用TBI模型開展腦損傷研究已取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些難以克服的不足。常用的TBI模型動(dòng)物(特別是嚙齒類動(dòng)物)的大腦與人腦在生理學(xué)上存在一定程度的相似性，但在腦結(jié)構(gòu)和功能方面仍存在顯著差異，如在腦幾何形狀、顱角度、回旋復(fù)雜性、灰質(zhì)與白質(zhì)灰分比例等方面均存在差異，這對(duì)TBI模型的建立會(huì)產(chǎn)生不良影響[11,33]。許多TBI模型的研究并未嚴(yán)格測(cè)量TBI前后的生理變量，包括CO2分壓、O2分壓、pH、血壓和腦溫等，而這些變量在確定機(jī)體對(duì)損傷和治療的病理生理反應(yīng)中非常重要。此外，年齡、性別、物種對(duì)TBI結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生影響[2,4,5,62～64]，需多加研究。而TBI體外模型的局限性主要表現(xiàn)在組織細(xì)胞可能在離體后產(chǎn)生有害的應(yīng)激反應(yīng)；其次，組織細(xì)胞在取材的過程中已經(jīng)受到損傷，這在一定程度上可能對(duì)組織的實(shí)驗(yàn)性損傷產(chǎn)生影響。TBI體外模型需要重點(diǎn)解決的問題是減少細(xì)胞外環(huán)境(如血液、活化的巨噬細(xì)胞等)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響，以及降低組織細(xì)胞在取材過程中造成的損傷[60,65,66]。有時(shí)，基于體內(nèi)模型與體外模型的研究會(huì)產(chǎn)生相互矛盾的結(jié)果，但這并不意味著體外模型檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，可能與環(huán)境(如炎癥反應(yīng)、溫度調(diào)節(jié)、氧合和局部離子濃度)的差異有密切關(guān)系[11,47,59,61,65,67]。利用2種TBI模型進(jìn)行研究各有利弊，因此，在研究一種新的治療手段或藥物時(shí)，應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用不同類型的TBI體內(nèi)、體外模型，以模擬在損傷期間引起的不同病理生物學(xué)反應(yīng)，采用這種交叉驗(yàn)證的方式，可使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為真實(shí)、可靠，減少假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

表1 常用TBI動(dòng)物模型及細(xì)胞模型的特點(diǎn)Table 1 Characteristics of common-used TBI animal and cell models.