施沈佳, 李劍瑛, 黎中寶, 陳俊德, 吳坤遠

1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門 361021；2.國家海洋局第三海洋研究所, 國家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)中心, 福建 廈門 361005；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院, 福州 350002

隨著城市化、工業(yè)化及全球化進程的加劇，以及生態(tài)環(huán)境惡化、生活方式改變、人類預(yù)期壽命延長等因素的影響，癌癥的發(fā)病率和死亡率均呈上升態(tài)勢，嚴重威脅著人類健康和社會發(fā)展，癌癥的防治已成為一個全球性問題[1,2]。

沒食子酸(gallic acid，GA)是一種天然多酚類物質(zhì)，作為沒食子單寧的主要水解單體，普遍存在于植物體中[3]。同時，沒食子酸作為傳統(tǒng)中藥材中的活性成分，具有抗氧化、抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種生理活性[4]，且具有產(chǎn)量大、價格低廉、易大規(guī)模生產(chǎn)的特點，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[5]，特別是在抗腫瘤的研究中，其因可口服、對腫瘤細胞具有高選擇性等特點而備受關(guān)注[6,7]。

血紅蛋白是紅細胞中的一種重要蛋白質(zhì)，其在將氧運輸至人體各器官和部位的過程中是必不可少的。血紅蛋白以四聚體形式存在，由2個α亞基和2個β亞基組成，每個α亞基由141個氨基酸殘基組成，每個β亞基由146個氨基酸殘基組成，其可通過與多種內(nèi)源性、外源性的分子結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)運、存儲的功能[8,9]。牛血紅蛋白(bovine hemoglobin，BHb)與人血紅蛋白高度同源，且易獲得，常用于血紅蛋白與小分子化合物結(jié)合的研究[10～13]。

在小分子化合物與蛋白質(zhì)的研究中，光譜檢測技術(shù)因具有靈敏度高、操作簡便等特點而被廣泛應(yīng)用。如在血紅蛋白與小分子化合物相互作用方面，紫外-可見光法可用于研究土霉素(oxytetracycline)對血紅蛋白基團和微環(huán)境的影響[10]；利用熒光猝滅法可研究頭孢匹胺鈉對血紅蛋白的猝滅機理(包括相互作用方式、相互作用力類型)[14]；通過同步熒光技術(shù)可研究4,4′-二異硫氰基芪-2,2′-二磺酸和2,4-二硝基酚對血紅蛋白氨基酸殘基微環(huán)境的影響[15]；紅外光譜可用于表征蛋白分子的化學(xué)鍵和官能團[16]；而利用圓二色光譜可研究香草醛對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響[17]。這說明光譜檢測技術(shù)能夠用于檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及其與小分子化合物相互作用后的變化，是一種有效的研究方法。

目前，對GA的研究主要集中于對其生物活性(如抗氧化、抑菌)和細胞水平(如抗腫瘤)的研究，與血紅蛋白結(jié)合的研究相對較少，且作用機制尚不明確。本研究利用光譜法研究了GA與BHb的相互作用，以期闡明GA在體內(nèi)的運輸及藥理作用，并進一步探究GA與BHb結(jié)合的特性，揭示其可能存在的毒副作用，以期為GA在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

沒食子酸(純度99%)購于美國阿拉丁工業(yè)公司；牛血紅蛋白(分子量64 500 Da)購于美國Sigma-Aldrich公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS；pH 7.0)購于美國EMD Millipore公司；溴化鉀(光譜純)購于美國PIKE公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為去離子水(deionized water；18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設(shè)備

F-2700型紫外熒光光度計(日本Hitachi公司)；UH5300型紫外分光光度計(日本島津公司)；VERTEX 70型傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(德國Bruker公司)；Chirascan型圓二色光譜儀(英國Applied photophsics公司)；SG2型pH計(德國Mettler Toledo公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1緩沖體系的配制及檢測樣品的制備 BHb用PBS配制成3×10-6mol/L儲備液，儲存于4℃冰箱中，用于紫外-可見光譜、熒光光譜和圓二色光譜檢測；用去離子水將PBS稀釋100倍，調(diào)節(jié)pH至7.0，稀釋后用其配制濃度為3×10-6mol/L的BHb溶液，用于傅里葉變換紅外光譜檢測。

GA用PBS配制成1×10-2mol/L儲備液，振蕩器混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2紫外-可見光譜與熒光光譜的檢測 準確移取2.5 mL BHb儲備液于1 cm石英比色皿中，分別在298 K和308 K下，溫水浴反應(yīng)8 min，在激發(fā)波長為280 nm、激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm的條件下，測定樣品的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，檢測完畢后，在原樣品中依次加入1×10-2mol/L GA儲備液2.5 μL，混勻，使得溶液中GA的濃度依次為0、1.0×10-5mol/L、2.0×10-5mol/L、3.0×10-5mol/L、4.0×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、6.0×10-5mol/L、7.0×10-5mol/L、8.0×10-5mol/L，測定不同濃度GA與BHb反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜。在相同條件下，分別固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，測定298 K組樣品的同步熒光光譜?？鄢齈BS的背景光譜。

1.3.3FTIR檢測 取10 mL BHb溶液，加入GA儲備液，使溶液中的GA濃度為8.0×10-5mol/L，置于298 K條件下水浴反應(yīng)8 min，以未加入GA儲備液的BHb溶液為對照。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品凍干。取凍干樣品各1 mg，分別加入100 mg溴化鉀粉末進行壓片，進行FTIR光譜檢測，設(shè)置參數(shù)：分辨率4 cm-1、樣品掃描時間16 s、背景掃描時間32 s、掃描范圍3 800～1 000 cm-1?？鄢寤浀谋尘肮庾V。

1.3.4CD檢測 分別取2.5 mL BHb溶液，加入GA儲備液，使溶液中的GA濃度分別為0、2.0×10-5mol/L 和8.0×10-5mol/L，于298 K條件下水浴反應(yīng)8 min。反應(yīng)結(jié)束后，各移取300 μL反應(yīng)溶液于1 mm石英池中，恒溫298 K，進行CD檢測，掃描波長范圍185～260 nm，帶寬 1.0 nm，步進為1 nm，單個數(shù)據(jù)點的采樣時間(time-per-point)為1 s，數(shù)據(jù)采集模式為Spectrum，以pH 7.0的PBS為背景，其光譜強度以摩爾消光系數(shù)差Δε[L/(mol·cm)]表示?？鄢齈BS的背景光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA對BHb血紅素基團的影響

紫外-可見光譜技術(shù)可用于探究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化、配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合活性[10]。圖1為不同濃度GA對BHb的紫外-可見光譜圖，在406 nm處有一個強吸收峰，為卟啉-Soret帶(π-π*躍遷帶)[18]，隨著GA濃度逐漸增大，406 nm處吸收峰位保持不變，說明GA與BHb的相互作用沒有改變血紅蛋白氧合狀態(tài)，不會使氧合血紅蛋白脫氧；而吸收峰強度隨著GA濃度增大而逐漸降低，由1.293 a.u.降至1.227 a.u.，下降了0.066 a.u.，下降幅度為5.1%，說明GA的加入使BHb的微環(huán)境發(fā)生了變化，但影響較小[19]；吸收峰變化幅度較小，說明GA和BHb之間的相互作用較弱[8]。綜合Soret帶峰位和吸收值的結(jié)果，說明GA對BHb的影響不直接作用于血紅素基團，即不改變BHb的氧合狀態(tài)[20]。

圖1 不同濃度沒食子酸與牛血紅蛋白相互作用的紫外-可見光譜Fig.1 UV-vis spectra of BHb in the presence of GA with various concentrations.注：0→8：在298 K條件下，3×10-6 mol/L BHb分別與0、1.0×10-5 mol/L、2.0×10-5 mol/L、3.0×10-5 mol/L、4.0×10-5 mol/L、5.0×10-5 mol/L、6.0×10-5 mol/L、7.0×10-5 mol/L、8.0×10-5 mol/L GA相互作用。

2.2 GA對BHb構(gòu)型的影響

BHb的內(nèi)源性熒光主要來源于色氨酸殘基和酪氨酸殘基，其對微環(huán)境的變化較為敏感，因而可利用熒光技術(shù)研究小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合，如結(jié)合機制、結(jié)合模式、結(jié)合常數(shù)等[14,21]。本研究利用該技術(shù)研究BHb和GA之間的相互作用。圖2為不同溫度下GA與BHb相互作用后的熒光光譜。

從圖2中可知，隨著GA濃度從0增加到8.0×10-5mol/L，BHb的最大發(fā)射波長峰位發(fā)生紅移，熒光強度逐漸減弱。當反應(yīng)溫度為298 K時(圖2A)，BHb的最大發(fā)射峰位從330 nm紅移至336.5 nm，熒光強度從120.9 a.u.下降至96.16 a.u.，熒光強度下降了24.74 a.u.，損失率為20.4%；當反應(yīng)溫度為308 K時(圖2B)，BHb的最大發(fā)射峰位從331 nm紅移至337 nm，熒光強度從119.9 a.u.下降到75.89 a.u.，熒光強度降低了44.01 a.u.，損失率為36.7%。330 nm處的發(fā)射峰是BHb中的色氨酸殘基和酪氨酸殘基的熒光發(fā)射峰[22]，發(fā)射峰發(fā)生位移是由于GA與BHb的相互作用從而使血紅蛋白分子的空間構(gòu)象產(chǎn)生改變[23]。熒光光譜的結(jié)果說明，GA與BHb相互作用發(fā)生了熒光猝滅，且溫度越高，熒光猝滅的效果越明顯。

圖2 不同濃度GA對BHb的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence quenching spectra of BHb in the presence of GA with various concentrations.注：0→8：在不同溫度條件下，3×10-6 mol/L BHb分別與0、1.0×10-5 mol/L、2.0×10-5 mol/L、3.0×10-5 mol/L、4.0×10-5 mol/L、5.0×10-5 mol/L、6.0×10-5 mol/L、7.0×10-5 mol/L、8.0×10-5 mol/L GA相互作用。

2.3 熒光猝滅

熒光猝滅的類型通?？煞譃閯討B(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是由熒光團之間的基態(tài)復(fù)合物形成而引起的。因此，靜態(tài)猝滅系統(tǒng)中增加溫度會使配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，猝滅常數(shù)KSV降低。與之相反，動態(tài)猝滅是由激發(fā)態(tài)熒光物質(zhì)與猝滅劑之間發(fā)生碰撞而引起熒光猝滅，溫度增加，KSV也隨之升高。動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅過程均可用Stern-Volmer方程表達[8]，即：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中,F0和F分別表示未加入和加入猝滅劑時體系的相對熒光強度；KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)(也稱Stern-Volmer猝滅常數(shù))；[Q]表示猝滅劑的濃度；Kq為熒光猝滅速率常數(shù)，各類猝滅劑對生物大分子的最大Kq值一般為2.0×1010L/(mol·s)；τ0為無猝滅劑時熒光物質(zhì)的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命一般約為10-8s。

根據(jù)式(1)制得圖3和表1。圖3是在不同溫度下GA對BHb的Stern-Volmer圖，相關(guān)系數(shù)>0.99，良好的擬合線性關(guān)系表明Stern-Volmer模型適用于GA和BHb相互作用機制的研究，也意味著在二者反應(yīng)過程中存在著一種主要的猝滅途徑[8]。由KSV和Kq值計算結(jié)果(表1)可知，隨著溫度升高，BHb的猝滅曲線斜率增大，說明猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大，因此，可初步判斷GA與BHb的熒光猝滅類型是動態(tài)猝滅。KSV數(shù)量級為103，Kq的數(shù)量級為1011，與最大擴散碰撞猝滅常數(shù)Kq=2.0×1010L/(mol·s)相比僅相差1個數(shù)量級，沒有遠大于最大猝滅常數(shù)；因此，判斷GA與BHb的結(jié)合為動態(tài)猝滅過程，即熒光猝滅由分子間的碰撞引起。

圖3 不同溫度下GA對BHb的熒光猝滅Stern-Volmer圖Fig.3 Stern-Volmer plots of fluorescence quenching of BHb in the presence of GA at different temperatures.

T(K)線性方程相關(guān)性系數(shù)(r)KSV(×103 L/mol)Kq[×1011 L/(mol·s)]298F0/F=0.990 1+0.003 5[Q]0.993 53.53.5308F0/F=0.996 7+0.007 3[Q]0.997 47.37.3

2.4 結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和作用力類型

小分子藥物與蛋白質(zhì)生物大分子發(fā)生作用時，體系中的小分子化合物與生物大分子之間處于一種平衡狀態(tài)，當猝滅類型為動態(tài)猝滅時，可用下列方程描述[24]：

lg(F0/F-1)=lgKa+nlg[Q]

(2)

式中,Ka和n分別表示結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)，F(xiàn)0為BHb的熒光發(fā)射強度，F(xiàn)為不同濃度GA與BHb相互作用的熒光發(fā)射強度。

通過以lg(F0/F-1)對lg[Q]作圖，由直線截距和斜率分別求得298 K、308 K時的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n，結(jié)果如表2所示。在298 K、308 K條件下，n值分別為1.09和1.04，均約等于1，這意味著BHb中僅存在1個GA的結(jié)合位點；GA和BHb之間的結(jié)合常數(shù)分別為7.941×103L/mol和10.478×103L/mol，Ka值隨著溫度的升高而增加；與其他猝滅類型為靜態(tài)猝滅的小分子和血紅蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)相比[8,18,26]，GA與BHb的結(jié)合常數(shù)相對較小，進一步證明GA與BHb間的猝滅是一個動態(tài)過程。

通常，小分子化合物與生物大分子之間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電作用力和疏水作用力等，可通過熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔΗ和熵變ΔS來確定。當反應(yīng)體系溫度變化不大時，焓變可看作是一個常數(shù)[27]。根據(jù)范特霍夫(Vant Hoff)公式及其推導(dǎo)公式，可以求得結(jié)合反應(yīng)的標準吉布斯自由能變ΔG、焓變ΔH、熵變ΔS：

ΔG=-RTlnK

(3)

ΔS=(ΔH-ΔG)/T

(4)

(5)

式中,K為小分子與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合常數(shù)，R為氣體分子常數(shù)(取R=8.314 5 J/mol·K)，T為小分子與蛋白質(zhì)相互作用時的開氏溫度，計算結(jié)果見表2。

表2 沒食子酸與BHb結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Binding constants, binding-site numbers and thermodynamics constants of the system of GA-BHb.

在298 K、308 K條件下，吉布斯自由能ΔG分別為-22.25 kJ/mol和-23.71 kJ/mol，均小于0，說明GA與BHb的反應(yīng)可自發(fā)進行。在藥物與生物大分子的反應(yīng)中，其主要作用類型可根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔΗ和熵變ΔS的大小來判斷：當ΔH、ΔS均大于0時為疏水作用力；當ΔH、ΔS均小于0時為氫鍵和范德華力；當ΔH<0、ΔS>0時為靜電相互作用。由表2可知，ΔH=21.15 kJ/mol，ΔS=145.64 J/(mol·K)，即ΔH、ΔS均大于0，說明GA與BHb之間的作用力主要為疏水作用力。另外，ΔH>0表明BHb和GA之間的相互作用過程是吸熱的，溫度的升高會促進BHb與GA的相互作用。從熒光猝滅的角度看，隨著溫度的升高，BHb熒光猝滅程度增強，Kq值增加[25]，與表1的結(jié)果相符。

2.5 GA對BHb發(fā)光基團的影響

在BHb中有多種能夠產(chǎn)生內(nèi)源性熒光的氨基酸殘基，其不利于進一步了解小分子化合物對蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。同步熒光光譜可以提供發(fā)色基團分子附近微環(huán)境變化的信息，具有靈敏度高、選擇性好的特點，被廣泛用于研究配體和蛋白質(zhì)之間的相互作用[15,28]。本研究利用同步熒光光譜技術(shù)將圖2A中相互重疊的芳香族氨基酸殘基的熒光峰分離，以便了解氨基酸微環(huán)境的變化。如圖4所示，當Δλ=15 nm時，291 nm附近顯示的是酪氨酸(Tyr)殘基的熒光峰(圖4A)；Δλ=60 nm時，279.5 nm附近可觀察到色氨酸(Trp)殘基的熒光峰(圖4B)。

圖4 不同濃度沒食子酸與牛血紅蛋白相互作用的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of BHb in the presence of GA with various concentrations.注：0→8：在298 K條件下，3×10-6 mol/L BHb分別與0、1.0×10-5 mol/L、2.0×10-5 mol/L、3.0×10-5 mol/L、4.0×10-5 mol/L、5.0×10-5 mol/L、6.0×10-5 mol/L、7.0×10-5 mol/L、8.0×10-5 mol/L GA相互作用。

由圖4可知，隨著GA濃度的增加，BHb的酪氨酸殘基和色氨酸殘基發(fā)生猝滅，熒光強度逐漸降低，最大熒光發(fā)射峰發(fā)生位移；酪氨酸殘基的最大發(fā)射峰由291 nm紅移至293.5 nm處，熒光強度由36.16 a.u.下降至24.74 a.u.，發(fā)射峰紅移2.5 nm，熒光強度降低了11.42 a.u.；色氨酸殘基的最大發(fā)射峰由279.5 nm紅移至280.5 nm處，熒光強度由113.5 a.u.下降至95.07 a.u.，發(fā)射峰紅移1 nm，熒光強度降低了18.43 a.u.。酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光發(fā)射峰位發(fā)生位移，說明二者所處環(huán)境的疏水性降低、極性增加，肽鏈的延伸程度增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松弛；色氨酸殘基熒光強度的下降程度大于酪氨酸殘基，這表明GA和色氨酸殘基之間的相互作用更強，GA與BHb分子的結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基而非酪氨酸殘基[25,29]。

2.6 利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)檢測GA對BHb二級結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR)光譜通常用于表征化學(xué)鍵和官能團，可以檢測BHb(3×10-6mol/L)在GA(8×10-5mol/L)作用下的結(jié)構(gòu)變化[16]。如圖5所示，圖5中a與b分別為GA與BHb作用前后的FTIR光譜，其中，a顯示在1 656 cm-1、1 537 cm-1、1 385 cm-1和1 241 cm-1譜帶，分別為BHb主鏈肽鍵產(chǎn)生的酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺IV帶和酰胺V帶；而b中相應(yīng)的譜帶分別出現(xiàn)在1 658 cm-1、1 541 cm-1、1 395 cm-1和1 251 cm-1處。

酰胺I帶是肽鏈C=O的伸縮振動，其間的1 651～1 658 cm-1是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰帶[18]。BHb與GA相互作用前后，在酰胺I帶的特征譜帶出現(xiàn)特征峰，說明BHb在GA作用前后均以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主；BHb與GA作用后，BHb的特征峰

圖5 牛血紅蛋白與沒食子酸作用前(a)后(b)的FTIR光譜圖Fig.5 FTIR spectra of BHb in the absence (a) and presence (b) of GA.

并未發(fā)生明顯的改變，因此說明BHb與GA作用后，并未改變BHb的化學(xué)結(jié)構(gòu)[30]?？傮w來看，GA與BHb相互作用后，BHb的二級結(jié)構(gòu)仍以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。

2.7 利用圓二色光譜技術(shù)檢測GA對BHb二級結(jié)構(gòu)的影響

BHb是一種以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主的蛋白質(zhì)，觀測其二級結(jié)構(gòu)的變化可以進一步確定GA對BHb結(jié)構(gòu)的影響。圓二色光譜(circular dichroism，CD)技術(shù)作為一種靈敏的光譜技術(shù)，常用于溶液中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的研究[17]。在蛋白質(zhì)與藥物分子相互作用時，其可用于監(jiān)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化。

由圖6中的a可知，BHb在靠近194 nm處有1個正的吸收峰，在209 nm和222 nm處表現(xiàn)為2個負的Cotton吸收峰，這是以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主的蛋白質(zhì)所具有的CD光譜特征；209 nm譜帶對應(yīng)的是α-螺旋結(jié)構(gòu)的π-π*躍遷帶，222 nm譜帶是α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的π-π*躍遷帶[18]。與GA作用后，如圖6中的b、c所示，BHb的3個吸收峰強度均減弱，但峰形和峰位并未發(fā)生變化。因而可推斷BHb與GA相互作用前后都以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。

圖6 不同濃度沒食子酸與牛血紅蛋白作用前(a)后(b,c)遠紫外圓二色光譜Fig.6 Far-UV CD spectra of BHb in the presence of GA with various concentrations.注：a: BHb，濃度為3×10-6 mol/L；b: BHb-GA, 其中GA濃度為2×10-5 mol/L；c: BHb-GA，其中GA濃度為8×10-5 mol/L。

利用定量分析程序CDNN對圖6的數(shù)據(jù)進行定量分析，擬合185～260 nm波長范圍內(nèi)的CD數(shù)據(jù)，結(jié)果如表3所示。BHb的二級結(jié)構(gòu)含量：α-螺旋含量為83.4%，β-折疊含量為2.3%，轉(zhuǎn)角含量為9.0%，無規(guī)則卷曲含量為8.6%。在與不同濃度GA相互作用后，可以看出BHb的α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量減少，β-折疊、轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)的含量均增加，且GA濃度的增加，加劇了這種趨勢。

表3 牛血紅蛋白與不同濃度沒食子酸作用前后二級結(jié)構(gòu)的含量Table 3 Fractions of secondary structure of BHb in the absence and presence of GA with various concertrations.

綜上所述，BHb與GA的相互作用使BHb的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少，β-折疊、轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)的含量均增加，但α-螺旋結(jié)構(gòu)仍為主要結(jié)構(gòu)。在骨架氫鍵、疏水作用力和范德華力等力的驅(qū)動下，螺旋結(jié)構(gòu)與側(cè)鏈熵呈逆向關(guān)系[14]。所以，BHb在與GA相互作用后α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少的現(xiàn)象說明，側(cè)鏈熵增加，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降，這與FTIR光譜檢測結(jié)果一致。BHb在與GA相互作用后，BHb的α-螺旋結(jié)構(gòu)變得疏松，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的變化，導(dǎo)致BHb熒光猝滅[5]。

3 討論

通過紫外-可見光譜、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜和圓二色光譜等手段，在pH 7.0條件下對GA和BHb的相互作用進行了研究。研究表明，GA與BHb的相互作用，結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級為103～104，小于其他小分子化合物和蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，結(jié)合類型為動態(tài)結(jié)合，能自發(fā)發(fā)生反應(yīng)，發(fā)生結(jié)合的主要作用力為疏水作用力，兩者的結(jié)合位點數(shù)只有1個，且結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基而非酪氨酸殘基。GA可動態(tài)猝滅BHb的內(nèi)源性熒光，擾動芳香族氨基酸所處的微環(huán)境，使分子內(nèi)部的酪氨酸、色氨酸所處微環(huán)境發(fā)生改變，色氨酸殘基受到的影響比酪氨酸殘基大。GA對BHb分子的二級結(jié)構(gòu)影響較小，反應(yīng)前后均以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。

總體而言，GA不會與BHb生成穩(wěn)定的復(fù)合物，也不會引起B(yǎng)Hb發(fā)生脫氧作用，對BHb蛋白的結(jié)構(gòu)影響較小。這為GA在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用以及發(fā)揮其止血抑菌、抗腫瘤功能的小分子提供了理論基礎(chǔ)，同時，對于GA在生物相關(guān)領(lǐng)域如藥物代謝動力學(xué)、毒理學(xué)、藥理學(xué)和生物化學(xué)等方面的研究提供了參考依據(jù)。