馬嘉偉, 王宇婷, 嚴(yán)振寧, 付雪晴, 趙靜雅

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 交大-復(fù)旦-諾丁漢植物生物技術(shù)研發(fā)中心, 上海 200240

瘧疾是由瘧原蟲引起的影響人類健康的傳染病，染上瘧疾會(huì)引起頭痛、發(fā)熱等一系列癥狀的出現(xiàn)，若情況繼續(xù)惡化，則可能導(dǎo)致昏迷甚至死亡[1]。2017年，全球瘧疾感染2.19億例，因瘧疾死亡人數(shù)為43.5萬人[2]。青蒿(ArtemisiaannuaL.)，又名黃花蒿，是一年生草本植物，莖直立、葉互生、地上部分多分枝，原產(chǎn)于中國(guó)，是我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，廣泛分布于全國(guó)各地[3]。1972年，我國(guó)研究人員從青蒿中分離得到抗瘧有效單體青蒿素，這一發(fā)現(xiàn)引起了全球科學(xué)家的廣泛關(guān)注；1981年，屠呦呦等[4]的研究表明青蒿素是一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦使用青蒿素聯(lián)合療法(artemisinin-based combination therapies，ACTs)以減少瘧疾死亡人數(shù)[5]。此外，研究報(bào)道青蒿素及其衍生物還具有抗病毒[6]、抗癌[7]和抗血吸蟲[8]的作用。目前，市場(chǎng)上青蒿素的生產(chǎn)主要來源于植物提取，但是青蒿素含量較低，僅為葉片干重的0.01%～1%[9]。盡管酵母半合成青蒿素已經(jīng)取得了成功，但其生產(chǎn)成本高，每年的生產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足全球青蒿素的需求量[10]。因此，利用植物代謝工程手段提高青蒿中青蒿素的含量是十分必要的。

圖1 青蒿素生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathways of artemisinin in A. annua.注：FPS：法尼基焦磷酸合酶；ADS：紫穗槐-4,11-二烯合成酶；CYP71AV1：紫穗槐-4,11-二烯氧化酶；CPR：細(xì)胞色素還原酶；ADH1：乙醇脫氫酶1；DBR2：青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶；ALDH1：乙醛脫氫酶1。

青蒿素合成途徑已經(jīng)基本解析清楚，如圖1所示，青蒿素合成前體物質(zhì)異戊烯基二磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其異構(gòu)體二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)分別來源于2種途徑：在胞質(zhì)中發(fā)生的甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑和在質(zhì)體中發(fā)生的2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-enthritol-4-phosphate，MEP)途徑[11]。法尼基焦磷酸(famesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)是青蒿素生物合成的直接底物，由IPP和DMAPP在法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS)的催化下生成。青蒿的分泌型腺毛是合成青蒿素的部位，青蒿素就儲(chǔ)存在蠟質(zhì)囊腔中[12,13]。從FPP開始的一系列催化反應(yīng)屬于青蒿中青蒿素特有的合成代謝途徑。FPP在紫穗槐-4,11-二烯合成酶(amorpha-4,11-diene synthase，ADS)的催化下生成紫穗槐二烯，這是進(jìn)入青蒿素特異代謝途徑的第一步重要反應(yīng)[14,15]。然后在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶(amorpha-4,11-diene 12-hydroxylase，CYP71AV1)及其配體細(xì)胞色素還原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)和乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)的作用下，紫穗槐二烯氧化水解生成青蒿酸[16]。在青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶(artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase，DBR2)與ALDH1的催化下形成二氫青蒿酸[17,18]。而青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素B和二氫青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素的過程是非酶促光氧化過程[19,20]。

轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠特異結(jié)合基因的啟動(dòng)子從而調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，如蘋果(Malusdomestica)轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1可以與MdCOP1s互作，并通過直接結(jié)合花青素合成酶基因MdUFGT和MdDFR啟動(dòng)子以調(diào)控花青素的合成[21]。目前的研究也證明了轉(zhuǎn)錄因子廣泛地參與了青蒿素的生物合成過程。在青蒿中，屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的AaORA能夠調(diào)控ADS、CYP71AV1和DBR2的表達(dá)水平從而提高青蒿素的生物合成[22]。本課題組從青蒿中克隆了AabZIP1轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)AabZIP1能夠直接結(jié)合ADS和CYP71AV1的啟動(dòng)子，通過促進(jìn)ADS和CYP71AV1基因的表達(dá)來調(diào)控青蒿素的合成[23]；同時(shí)還克隆了1個(gè)受茉莉酸誘導(dǎo)的bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子AaMYC2，其可通過與CYP71AV1和DBR2的啟動(dòng)子結(jié)合影響青蒿素的合成[24]。而屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的AaGSW1不僅受到AabZIP1和AaMYC2的直接調(diào)控，還能夠結(jié)合CYP71AV1和AaORA的啟動(dòng)子從而通過多條路徑實(shí)現(xiàn)對(duì)青蒿素合成的調(diào)控[25]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及代謝過程。然而，目前對(duì)青蒿中MYB類轉(zhuǎn)錄因子的研究相對(duì)較少，只有Matías-Hernández等[26]在青蒿中克隆了AaMYB1，當(dāng)在青蒿中過表達(dá)AaMYB1基因時(shí)，多個(gè)青蒿素合成途徑的關(guān)鍵酶基因，尤其是ADS和CYP71AV1，基因表達(dá)量顯著提高，轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量也顯著提高。

光作為重要的環(huán)境因子之一，不僅為植物提供生存的能量，還影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[27]。植物可通過光敏色素、隱花色素、向光素和紫外光受體接收光信號(hào)，并形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)光信號(hào)[28]。多項(xiàng)研究表明，光信號(hào)廣泛地參與了植物次生代謝產(chǎn)物的合成。Hong等[29]通過在青蒿中過量表達(dá)擬南芥(Arabidopsisthaliana)藍(lán)光受體AtCRY1基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因青蒿植株中青蒿素的含量。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，植物激素茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)促進(jìn)青蒿素的合成是依賴于光的，在黑暗條件下MeJA處理后的青蒿幼苗中青蒿素合成酶基因ADS、CYP71AV1和ALDH1表達(dá)量并沒有提高[30]。Zhang等[31]使用不同光質(zhì)處理青蒿幼苗，持續(xù)2 d后測(cè)定青蒿中的青蒿素及青蒿酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與白光相比，紅光處理的青蒿幼苗積累了更多的青蒿素及青蒿酸。由此可見，紅光能夠促進(jìn)青蒿素的合成，但是紅光調(diào)控青蒿素合成的機(jī)制尚未被揭示。

本研究通過對(duì)紅光處理6 h的青蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出MYB類轉(zhuǎn)錄因子AaBPF1，推測(cè)AaBPF1可能參與了紅光調(diào)控青蒿素的合成，并通過生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)模式分析、Dual-luciferase系統(tǒng)檢測(cè)以及轉(zhuǎn)基因植株中目的基因表達(dá)量、青蒿素含量分析等進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，以期為揭示光調(diào)控青蒿素合成機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，并為青蒿素代謝工程提供良好的候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)使用的所有青蒿種子均來自重慶，保存于交大-復(fù)旦-諾丁漢植物生物技術(shù)研究中心,本實(shí)驗(yàn)使用的煙草為本氏煙草(Nicotianabenthamiana)。青蒿及煙草的生長(zhǎng)條件：16 h光照、8 h黑暗，于24℃培養(yǎng)間進(jìn)行培養(yǎng)。

KOD DNA聚合酶購(gòu)于日本東洋紡績(jī)株式會(huì)社，Taq酶、PrimeScriptRTreagent kit(Perfect Real Time)試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司，植物總RNA提取試劑盒、SuperReal PreMix Plus定量試劑盒均購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒購(gòu)于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，Axygen膠回收試劑盒、Axygen質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司，非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit)購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司，Gateway系統(tǒng)(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Mastercycler nexus PCR儀(德國(guó)艾本德股份公司)，PTC-200 Peltier Thermal Cycler熒光定量PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)，Water alliance 2695液相分析儀(沃物世科技(上海)有限公司)，ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)奧泰科技有限公司)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和基因表達(dá)分析

選取14 d左右、生長(zhǎng)一致的青蒿幼苗置于黑暗中預(yù)處理24 h，隨后轉(zhuǎn)入40 μmol/m2·s的紅光條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h。各取3份處理0 h和6 h的青蒿葉片(5株青蒿幼苗混樣)用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和注釋。

收集青蒿植株的不同組織(根、莖、幼葉、老葉和花蕾)，迅速置于液氮中，研磨至粉末后提取RNA，并利用PrimeScriptRTreagent kit(Perfect Real Time)試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)原則，在非保守域設(shè)計(jì)基因特異性引物(引物序列見表1)，擴(kuò)增產(chǎn)物約150～300 bp，選擇青蒿β-actin作為qRT-PCR內(nèi)參基因，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系：cDNA模板3 μL，2×SuperReal PreMix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：94℃ 10 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.4 AaBPF1基因克隆和載體構(gòu)建

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中AaBPF1拼接序列設(shè)計(jì)基因特異性引物(引物序列見表1)，用KOD plus DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，AaBPF1-F 1.5 μL，AaBPF1-R 1.5 μL，dNTPs 5 μL，MgCl22.5 μL，10×KOD Plus Buffer 5 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序：94℃ 10 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，68℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)；68℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，利用Axygen膠回收試劑盒回收目的片段，并與pJET載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，將陽(yáng)性菌液交至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。

通過網(wǎng)站(http://web.expasy.org/translate/)獲得AaBPF1氨基酸序列，利用Conserved Domain Database(CDD)預(yù)測(cè)核苷酸結(jié)合域(nucleotide-binding domain，NBD)。利用特異性引物BamHI-AaBPF1-F及AaBPF1-SpeI-R擴(kuò)增AaBPF1片段(PCR反應(yīng)體系及程序參照KOD plus DNA聚合酶擴(kuò)增)，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit將該片段連接到pHB-YFP載體BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)上，以構(gòu)建過量表達(dá)載體。再利用特異性引物Topo-AaBPF1-F、Topo-AaBPF1-R擴(kuò)增部分AaBPF1片段(PCR反應(yīng)體系及程序參照KOD plus DNA聚合酶擴(kuò)增)，利用Gateway系統(tǒng)(Invitrogen公司)構(gòu)建pHellsgate12-AaBPF1干擾載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，將陽(yáng)性菌液交至公司測(cè)序。測(cè)序鑒定無誤后，利用Axgen質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，具體按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。所用引物序列見表1。將構(gòu)建完成的過量表達(dá)載體和干擾載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，用于青蒿遺傳轉(zhuǎn)化[32]。同時(shí)，將pHB-AaBPF1-YFP載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，采用農(nóng)桿菌注射法侵染煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，用于觀察亞細(xì)胞定位[33]。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers used in this study.

注：下劃線為BamHⅠ和SpeⅠ的酶切位點(diǎn)。

1.5 Dual-luciferase實(shí)驗(yàn)分析AaBPF1調(diào)控青蒿素合成

擴(kuò)增ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1啟動(dòng)子片段(PCR反應(yīng)體系及程序參照KOD plus DNA聚合酶擴(kuò)增，所用引物序列見表1)，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit將PCR產(chǎn)物分別連接到載體pGREEN0800EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)上，與pSOUP18質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將含有啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子的農(nóng)桿菌按照1∶1混合，用農(nóng)桿菌注射法進(jìn)行煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，使用Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.6 青蒿的遺傳轉(zhuǎn)化及分析

用75%乙醇浸泡青蒿種子1 min，10%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水反復(fù)沖洗數(shù)次，將處理后的種子鋪在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。幼苗長(zhǎng)至5 cm左右時(shí)，剪下葉片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2 d，之后將外植體轉(zhuǎn)至發(fā)芽篩選培養(yǎng)基，在25℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)2周，約3次繼代后，獲得潮霉素抗性的叢生芽，隨后挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的叢生芽剪下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，生根后獲得再生青蒿植株，移至土壤中進(jìn)行培養(yǎng)。

待轉(zhuǎn)基因青蒿生長(zhǎng)2個(gè)月后，取其第一片葉提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后利用熒光定量PCR分析目的基因的表達(dá)量(引物序列見表1)，具體方法參照1.3中的基因表達(dá)分析。

取2個(gè)月大小的轉(zhuǎn)基因青蒿葉片于50℃烘箱中烘干，用研缽研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.1 g粉末，加入1 mL甲醇，30℃、50 W超聲30 min，12 000 r/min離心10 min后吸取上清液于2 mL離心管中；向沉淀中加入1 mL甲醇，再次超聲提取，離心后吸取上清液并與第一次上清液混勻，經(jīng)0.45 μm過濾器過濾后進(jìn)樣進(jìn)行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。使用Water alliance 2695液相分析儀、Waters C18 色譜柱，測(cè)定青蒿素的流動(dòng)相為甲醇∶水=60%∶40%(V/V)，測(cè)定二氫青蒿酸和青蒿酸的流動(dòng)相為乙腈∶0.1%冰醋酸=60%∶40%(V/V)，流速均為1.0 mL/min；使用ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，載氣壓為5×105Pa，檢測(cè)器漂移管溫度設(shè)定為40℃。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出青蒿素在樣品干重中所占的比例。

1.7 數(shù)據(jù)分析

本研究使用TopHat軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析(http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)。qRT-PCR的結(jié)果分析選擇Ct比較法，使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與分析。所有圖中的誤差線(n=3)皆為標(biāo)準(zhǔn)差，且顯著性差異分析使用Student’st檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅光誘導(dǎo)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子的篩選

將黑暗預(yù)處理后的青蒿幼苗置于40 μmol/m2·s 紅光下處理6 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接注釋。將樣品的Unigenes的RPKM值均一化處理后篩選出差異基因，其中，青蒿素合成相關(guān)酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)的表達(dá)在紅光處理6 h后均上升(圖2A)。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子是一類多功能的蛋白質(zhì)家族，其參與了植物整個(gè)生命過程的調(diào)節(jié)，包括植物生長(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)節(jié)、光形態(tài)建成的調(diào)控、植物激素合成及信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控等。通過差異分析，本研究篩選出紅光處理6 h后表達(dá)上升的3個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子(contig009201、contig007402以及contig003750；圖2A)。如圖2B所示，qRT-PCR進(jìn)一步證明青蒿素合成酶基因、contig009201、contig007402和contig003750基因表達(dá)量在處理后6 h顯著高于0 h。結(jié)果表明contig009201、contig007402和contig003750很可能參與紅光調(diào)控青蒿素合成，因此，選擇這3個(gè)基因作為本研究的候選基因。

2.2 紅光誘導(dǎo)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)分析

青蒿素只在青蒿的分泌型腺毛中合成，青蒿素合成酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)的表達(dá)也具有組織特異性，均在花蕾中表達(dá)量最高，其次是幼葉[34]。qRT-PCR分析3個(gè)候選基因在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3A～C所示，其中，contig009201在花蕾中表達(dá)量最高，其次是幼葉，在根和莖中的表達(dá)量較低。該表達(dá)模式與青蒿素合成酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)類似，而其他2個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)模式與之不同。因此，選擇contig009201作為本研究的目的基因。

圖2 受紅光誘導(dǎo)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子的篩選Fig.2 Screening of MYB transcription factors induced by red light.注：A：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中青蒿素合成途徑中關(guān)鍵酶基因及篩選到的3個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子紅光處理后的基因表達(dá)；其中，綠色為低表達(dá)，顏色越深，代表表達(dá)量越高；紅色為高表達(dá)，顏色越淺，代表表達(dá)量越高。B：qRT-PCR驗(yàn)證青蒿素合成途徑中關(guān)鍵酶基因及篩選到的3個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子紅光處理后的基因表達(dá)。0為紅光處理0 h；6 h為紅光處理6 h。

圖3 3個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因在青蒿不同組織中的表達(dá)量Fig.3 Relative expression of three MYB transcription factor genes in different tissues of Artemisia annua.

2.3 AaBPF1的克隆與分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，以青蒿cDNA為模板擴(kuò)增得到目的基因contig009201編碼區(qū)片段，命名為AaBPF1，其全長(zhǎng)為1 932 bp，編碼643個(gè)氨基酸。使用pI/Mw工具(http://www.expasy.org)，可知該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為9.14，分子量為72.2 kDa。使用NCBI分析該序列發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子屬于MYB家族R3-MYB。多重序列比對(duì)顯示AaBPF1與長(zhǎng)春花BPF同源性為56.1%，與歐芹BPF的同源性為55.4%(圖4A)。

AaBPF1的C端融合了黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)，從而形成AaBPF1-YFP融合蛋白。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，利用激光共聚焦顯微鏡觀察AaBPF1的亞細(xì)胞定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AaBPF1定位于細(xì)胞核中(圖4B)。

2.4 AaBPF1與青蒿素合成的調(diào)控分析

將青蒿素合成酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)啟動(dòng)子序列構(gòu)建到Dual-luciferase系統(tǒng)(圖5A)，分別與AaBPF1過量表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，以驗(yàn)證AaBPF1是否調(diào)控青蒿素的合成。如圖5B所示，Dual-luciferase系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明AaBPF1能夠顯著激活A(yù)DS和CYP71AV1基因的表達(dá)。

2.5 過量表達(dá)AaBPF1轉(zhuǎn)基因青蒿植株分析

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得70棵抗性植株，PCR鑒定后獲得63棵AaBPF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因青蒿植株。提取轉(zhuǎn)基因青蒿植株第一片葉RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，其中基因表達(dá)量最高的5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(BPF1-12、BPF1-22、BPF1-27、BPF1-44和BPF1-65)的結(jié)果如圖6A所示，轉(zhuǎn)基因植株中AaBPF1基因表達(dá)量顯著高于野生型對(duì)照，最高為野生型的18.8倍。隨后選擇這5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖7A)。過量表達(dá)AaBPF1基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株中ADS和CYP71AV1表達(dá)量顯著上調(diào)，而DBR2和ALDH1基因表達(dá)量也有所提高，可能是上游基因表達(dá)量提高使代謝流增加所致(圖6B)。HPLC

圖4 AaBPF1的生物信息學(xué)分析以及亞細(xì)胞定位Fig.4 Bioinformatics analysis and subcellular localization of AaBPF1.注：A：AaBPF1蛋白和其他植物BPF蛋白的比對(duì)，比對(duì)的BPF蛋白分別為長(zhǎng)春花(CrBPF;CAC19789.1)及歐芹(PcBPF;CAA48413.1)，序列中高度保守的氨基酸用黃底表示，部分保守序列用藍(lán)底表示；B：AaBPF1在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位。

圖5 AaBPF1調(diào)控青蒿素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)Fig.5 Expression of artemisinin biosynthetic genes regulated by AaBPF1.注：A：Dual-luciferase實(shí)驗(yàn)所使用載體系統(tǒng)；B：Dual-luciferase實(shí)驗(yàn)結(jié)果。**表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

圖6 過量表達(dá)AaBPF1轉(zhuǎn)基因青蒿植株分析Fig.6 Analysis of transgenic Artemisia annua plants with overexpression of AaBPF1.注：A：AaBPF1的基因表達(dá)；B：青蒿素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)；C：轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素的含量。CK為野生型植物(非轉(zhuǎn)基因植物)，其余為轉(zhuǎn)基因植株。*和**分別表示實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)與CK相比差異達(dá)到顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)。

圖7 轉(zhuǎn)基因青蒿植株Fig.7 Transgenic Artemisia annua plants.注：A：AaBPF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因青蒿植株；B：AaBPF1 RNAi干擾轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

測(cè)定青蒿素結(jié)果如圖6C所示，過量表達(dá)AaBPF1基因的青蒿中，青蒿素的含量最高約為18.4 mg/g (DW)，而對(duì)照組野生型青蒿中青蒿素的含量約為10.21 mg/g (DW)。上述結(jié)果證明，AaBPF1可能通過激活青蒿素合成酶基因的表達(dá)來正調(diào)控青蒿素的合成。

2.6 RNAi干擾AaBPF1轉(zhuǎn)基因青蒿植株分析

構(gòu)建AaBPF1 RNAi干擾載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，共獲得32棵AaBPF1 RNAi干擾轉(zhuǎn)基因青蒿植株。經(jīng)qRT-PCR分析，其中基因表達(dá)量最低的5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(BPF1-RNAi-2、BPF1-RNAi-7、BPF1-RNAi-13、BPF1-RNAi-15和BPF1-RNAi-26)的結(jié)果如圖8A所示，可知轉(zhuǎn)基因青蒿中AaBPF1基因表達(dá)被顯著抑制。選擇這5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行后續(xù)研究(圖7B)。抑制AaBPF1基因表達(dá)并未導(dǎo)致青蒿素合成酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)表達(dá)全部降低，僅有AaBPF1基因抑制效果最好的轉(zhuǎn)基因株系BPF1-RNAi-7的ADS、CYP71AV1和DBR2基因表達(dá)量顯著降低(圖8B)。轉(zhuǎn)基因青蒿BPF1-RNAi-7的青蒿素含量顯著低于野生型對(duì)照，其他轉(zhuǎn)基因株系青蒿素含量略低于野生型或與野生型植株無顯著差異(圖8C)。這可能是由于青蒿素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜，而AaBPF1很可能處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游；此外，MYB類轉(zhuǎn)錄因子的功能冗余較多。

圖8 RNAi干擾AaBPF1轉(zhuǎn)基因青蒿植株分析Fig.8 Analysis of transgenic Artemisia annua plants RNAi silencing AaBPF1.注：A：AaBPF1的基因表達(dá)；B：青蒿素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá) ；C：轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素的含量。CK為野生型植物(非轉(zhuǎn)基因植物)，其余為轉(zhuǎn)基因植株。*和**分別表示實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)與CK相比差異達(dá)到顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)。

3 討論

光照除了可以通過光形態(tài)建成改變植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還能影響植物的次生代謝。一般情況下，較長(zhǎng)波段的光(如紅光)，可以降低植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的含量；短波段的光(如藍(lán)光)，有利于黃酮類物質(zhì)的積累。如紅光處理會(huì)導(dǎo)致煙葉(NicotianatabacumL.)中黃酮的含量降低[35, 36]。但也有研究表明，遮蔭處理會(huì)讓高山紅景天(RhodiolasachalinensisA. Bor)根內(nèi)積累的紅景天苷數(shù)量變少，而紅光處理下，高山紅景天根內(nèi)積累的紅景天苷含量會(huì)升高[37]。此外，紅光處理還可以顯著增加番茄(Solanumlycopersicum)果實(shí)(著色期)中番茄紅素的含量[38]、丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)幼苗根系中丹酚酸B的含量[39]。在光調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物合成的研究中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子備受關(guān)注。蘋果中花青素必須在光的參與下才能合成，從蘋果中克隆的MYB家族的MdMYB1、MdMYB10和MdMYBA均是受光誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控花青苷合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，在花青苷合成中發(fā)揮著重要作用[40,41]。將番茄置于強(qiáng)光下，番茄的R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子SlAN1和SlAN2基因表達(dá)量顯著提高，從而促進(jìn)花青素合成中關(guān)鍵基因的表達(dá)，使花青素在番茄苗中的合成和積累[42]。

本研究利用單色光紅光處理青蒿幼苗，并對(duì)測(cè)序所得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析和共表達(dá)分析，成功篩選到MYB類轉(zhuǎn)錄因子AaBPF1。Dual-luciferase系統(tǒng)檢測(cè)以及轉(zhuǎn)基因植株的目的基因表達(dá)、青蒿素含量分析的結(jié)果顯示，AaBPF1很可能是通過調(diào)節(jié)ADS和CYP71AV1基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)青蒿素合成的調(diào)控。通過已報(bào)道的對(duì)ADS和CYP71AV1啟動(dòng)子序列的分析，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)均具有MYB結(jié)合的順式作用元件[43,44]。因此，AaBPF1有可能是直接結(jié)合ADS和CYP71AV1啟動(dòng)子調(diào)控其基因表達(dá)水平，從而調(diào)控青蒿素的合成；除此之外，AaBPF1也可能與其他轉(zhuǎn)錄因子(如bHLH類轉(zhuǎn)錄因子)通過蛋白相互作用，間接實(shí)現(xiàn)對(duì)ADS和CYP71AV1基因表達(dá)的調(diào)控。然而，AaBPF1的RNAi株系對(duì)青蒿素合成的影響并不明顯，這可能是由于青蒿素合成途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜且MYB類轉(zhuǎn)錄因子的功能冗余較多，因此造成AaBPF1的RNAi株系青蒿素含量變化不明顯。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子的研究主要都集中在R2R3MYB，而R3MYB的功能研究相對(duì)較少。在已報(bào)道的R3MYB亞家族中，幾乎都是負(fù)調(diào)控因子[45]，因此，本研究發(fā)現(xiàn)的AaBPF1正調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成具有重要的意義，不僅是對(duì)紅光調(diào)控青蒿素合成機(jī)制的初步探索，也為青蒿素植物代謝工程提供了良好的候選基因。