何 潔, 郭采平

深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司, 廣東 深圳 518107

1945年，Holmberg和Laurell首次在人血清中發(fā)現(xiàn)了一種非血紅素結(jié)合鐵的蛋白，將其命名為轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)[1]。人轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種重要的β-球蛋白，是人血漿和組織細胞外空間的主要鐵載體，主要負責把鐵離子從吸收和儲存的地方運輸?shù)郊t細胞供合成血紅蛋白用，或輸送到機體的其他需鐵部位，在鐵代謝過程中起著重要作用。正常情況下，人體中轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量是相對穩(wěn)定的，轉(zhuǎn)鐵蛋白在人體中的含量水平對機體健康具有重要的參考意義。

人轉(zhuǎn)鐵蛋白具有一系列的重要應用：由于轉(zhuǎn)鐵蛋白對鐵特有的結(jié)合力從而具有抗氧化和抗菌的作用；還可作為無血清培養(yǎng)中的添加劑，促進細胞增殖；另外轉(zhuǎn)鐵蛋白在臨床先天性無轉(zhuǎn)鐵蛋白性貧血、血色素沉積癥、鐵功能缺乏癥、冠心病、局部出血、再灌注損傷、器官移植以及癌癥等相關(guān)疾病治療中有著重要的作用[2]。本文綜述了轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)特性和生理功能，以及其分離純化工藝和臨床應用進展，以期為未來轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品的研究開發(fā)提供參考。

1 人轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)特性

人轉(zhuǎn)鐵蛋白是一個由679個氨基酸殘基組成的單鏈糖蛋白，糖基含量約為分子量的6%，含有19個二硫鍵，分子量為79 kDa，等電點pI為5.9，由N端(336個氨基酸殘基)和C端(343個氨基酸殘基)兩個具有高度同源性的結(jié)構(gòu)域組成[3,4]，C端和N端結(jié)構(gòu)域由一短肽連接，這兩個結(jié)構(gòu)域又由兩個小亞基組成，這兩個小亞基通過相互作用形成一個八面體結(jié)構(gòu)的金屬離子結(jié)合位點，能可逆地結(jié)合Fe3+，兩端金屬離子結(jié)合位點都有4個保守氨基酸，包括兩個酪氨酸、1個天門冬氨酸和1個組氨酸(N端-Asp-63、Tyr-95、Tyr-188和His-249)，F(xiàn)e3+與兩個酪氨酸的氧原子、1個組氨酸的氮原子、1個天門冬氨酸的氧原子和碳酸陰離子中的兩個氧原子通過配位鍵形成1個穩(wěn)定八面體結(jié)構(gòu)，1個轉(zhuǎn)鐵蛋白分子可以結(jié)合兩個Fe3+，轉(zhuǎn)鐵蛋白還可結(jié)合其他金屬離子，不過結(jié)合力相對弱一點[3,4]。

根據(jù)轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合Fe3+的數(shù)目及位點的不同，可將轉(zhuǎn)鐵蛋白分為4種類型：無Fe3+結(jié)合的脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、N端結(jié)合Fe3+的單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、C端結(jié)合Fe3+的單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合兩個鐵離子的飽和鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白。在正常生理狀態(tài)下，轉(zhuǎn)鐵蛋白對鐵離子的結(jié)合力在pH 7.4時最高，結(jié)合常數(shù)約為1022，飽和度為30%左右[4]。鐵飽和度低于20%，表明有鐵缺乏的現(xiàn)象，而高于50%則意味著鐵超載，超過80%則會出現(xiàn)非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵的現(xiàn)象，會對組織造成損傷[5]。

2 人轉(zhuǎn)鐵蛋白的生理功能及作用機制

轉(zhuǎn)鐵蛋白在人血漿蛋白中含量為2～3 g/L，是血液中最主要的鐵轉(zhuǎn)運蛋白，可轉(zhuǎn)運鐵到紅細胞中用于血紅蛋白的合成或者其他快速分裂的細胞，還可結(jié)合飲食吸收的鐵以及巨噬細胞釋放的鐵，在鐵代謝中起著非常重要的作用[6]。當體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白含量低于0.1 g/L，容易發(fā)生致病菌感染、生長遲緩以及貧血等疾病[7]。雖然轉(zhuǎn)鐵蛋白是鐵代謝過程中最重要的蛋白，但轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵只有3～4 mg左右，約占人體內(nèi)總鐵量的0.1%，60%～70%的鐵存在于血紅細胞腔室中，其他鐵存在于其他蛋白，如鐵蛋白和肌紅蛋白等。正常生理情況下，轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵轉(zhuǎn)運是高度動態(tài)的，每天約30 mg的鐵轉(zhuǎn)運到細胞中，體內(nèi)鐵存儲情況也是高度穩(wěn)定的，每天只會損失1～2 mg鐵，鐵平衡可通過日常飲食攝入保持[8,9]。在鐵代謝的過程中，發(fā)現(xiàn)由肝細胞合成的肝殺菌肽是維護體內(nèi)鐵平衡的一種重要因子，能夠調(diào)節(jié)血漿鐵濃度。肝殺菌肽含量升高時，血漿鐵濃度降低，容易導致貧血。相反，則會引起血漿非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵含量升高。目前已有研究表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白的功能不僅僅是轉(zhuǎn)運鐵，還會與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，誘導肝殺菌肽的表達，從而進一步調(diào)節(jié)鐵代謝[10～12]。

轉(zhuǎn)鐵蛋白主要在肝臟中合成，是一種急性蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白含量能反映人體的健康狀況。發(fā)生炎癥時，轉(zhuǎn)鐵蛋白會抑制性表達。在懷孕過程中，轉(zhuǎn)鐵蛋白會升高。缺鐵性貧血情況下，轉(zhuǎn)鐵蛋白的飽和度降低。在某些疾病或者處理條件下，轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵結(jié)合能力超載，會有轉(zhuǎn)鐵蛋白未結(jié)合的游離鐵，導致非血細胞里面的鐵累積，從而對心臟、肝臟以及其他器官產(chǎn)生嚴重損傷[13,14]。

轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)運鐵是通過網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導的細胞內(nèi)吞作用來運行的(圖1)。首先飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白與細胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，然后由網(wǎng)格蛋白介導內(nèi)吞作用，發(fā)出內(nèi)吞信號，形成內(nèi)涵體(endosome)。之后通過質(zhì)子化降低內(nèi)涵體的pH，鐵就會被釋放出來用于血紅蛋白的合成或者以鐵蛋白的形式儲存起來。最后無鐵的脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白就從轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表面釋放到血液中，從而進行下一循環(huán)的鐵轉(zhuǎn)運。一個轉(zhuǎn)鐵蛋白的分子在其生命周期內(nèi)(半衰期約8天)可進行數(shù)百次的循環(huán)[15]。

3 人轉(zhuǎn)鐵蛋白的制備工藝

3.1 血液制品純化背景

血液制品是全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要組成部分，國際上血液制品的開發(fā)主要依靠三種純化方法：鹽析法、低溫乙醇法和層析分離法。早期開發(fā)的鹽析法得到的血漿蛋白純度低；20世紀40年代，Cohn[16]發(fā)明了低溫乙醇法提取血漿蛋白，大大提高了純度和收率。20世紀70年代，國際上已經(jīng)引入了層析法分離血液制品，進一步提高了生產(chǎn)效率。我國血液制品技術(shù)發(fā)展較慢，20世紀80年代鹽析法才被利用進行人血白蛋白和免疫球蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。20世紀90年代，采用低溫乙醇法提高產(chǎn)品收率和質(zhì)量，直至2005年時，國內(nèi)才慢慢引進層析技術(shù)，凝血因子類產(chǎn)品開始大量上市。相比于其他血液制品的發(fā)展歷程，轉(zhuǎn)鐵蛋白發(fā)現(xiàn)較晚，20世紀40年代，Holmberg[1]和Schade[17]首次在血漿中發(fā)現(xiàn)和分離轉(zhuǎn)鐵蛋白。隨著低溫乙醇法分離血漿蛋白的技術(shù)發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白主要存在于Cohn低溫乙醇沉淀法的組分FIV沉淀中。在人血白蛋白的生產(chǎn)工藝中，F(xiàn)IV沉淀一般作為廢棄物，所以從FIV沉淀中提取轉(zhuǎn)鐵蛋白，既可以提高血漿的綜合利用率，又不影響人血白蛋白的生產(chǎn)，后來的研究者更多地采取從FIV沉淀中提取轉(zhuǎn)鐵蛋白。

圖1 轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)運鐵作用機制[15]Fig.1 Mechanism of the Fe iron transport by transferrin[15].

3.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白純化工藝

轉(zhuǎn)鐵蛋白的分離純化方法包含乙醇沉淀、利凡諾沉淀、硫酸銨沉淀、PEG沉淀和離子交換層析等[18～27]。早期主要使用沉淀法，后來隨著層析技術(shù)的發(fā)展，層析技術(shù)逐漸代替沉淀法或與沉淀法共同使用提高純度及回收率。同時，為了轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠用于臨床或者在藥品生產(chǎn)過程中作為生化試劑，更多的生產(chǎn)工藝都會加入病毒滅活的步驟，達到安全的效果。表1總結(jié)了至今轉(zhuǎn)鐵蛋白大規(guī)模生產(chǎn)工藝的發(fā)展情況，生產(chǎn)工藝從早期的沉淀法演變到后來的層析法，純度和回收率也有顯著提升，并加入病毒滅活步驟，保證安全性。例如，von Bonsdorff 和Parkkinen等利用PEG沉淀、一步陽離子交換層析和一步陰離子交換層析，加入有機溶劑/表面活性劑法(solvent/detergent，簡稱S/D)病毒滅活和納濾步驟，得到純度>98%的轉(zhuǎn)鐵蛋白[23,24]。MacCann等[25]以Cohn FII+III上清液為原料，經(jīng)過兩步的陰離子交換層析來純化得到轉(zhuǎn)鐵蛋白。Shabtai[26]以Cohn FIV-1懸浮液為原料，經(jīng)過PEG沉淀和二步陰離子交換層析，再經(jīng)過60℃ 10 h病毒滅活，得到轉(zhuǎn)鐵蛋白。Ascione等[27]以Cohn FIV-1+FIV-4為原料，經(jīng)過一步陰離子交換層析和兩步病毒滅活，即可得到回收率80%，純度大于95%的轉(zhuǎn)鐵蛋白。

轉(zhuǎn)鐵蛋白根據(jù)結(jié)合鐵離子的情況不同，具有不同的形式，因而其生產(chǎn)工藝也有所區(qū)別。脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的生產(chǎn)需增加鐵去除的步驟，一般可通過降低緩沖液pH和添加螯合劑EDTA來實現(xiàn)。飽和鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白則需要在體系中添加Fe3+。另外，在病毒滅活方面，Haupt[28]指出巴氏滅活并不適于脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的滅活，加入檸檬酸鈉或者EDTA作為保護劑后，經(jīng)過60℃滅活10 h，脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白并未發(fā)生失活現(xiàn)象。目前，人血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白尚未有產(chǎn)品上市，只有荷蘭Sanquin 血液制品公司的轉(zhuǎn)鐵蛋白正在進行臨床Ⅰ期實驗，用于治療遺傳性轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥，其生產(chǎn)工藝主要包括PEG沉淀、陽離子交換層析和陰離子交換層析，使用S/D處理和納濾兩步病毒滅活及去除步驟，確保制品的安全性。

表1 人轉(zhuǎn)鐵蛋白大規(guī)模純化的方法Table 1 Methods of large-scale purification of human transferrin.

4 臨床應用進展

轉(zhuǎn)鐵蛋白的臨床應用主要集中在三個領域：轉(zhuǎn)鐵蛋白替代治療、鐵代謝中的鐵結(jié)合/調(diào)節(jié)治療以及藥物載體。表2列出了人轉(zhuǎn)鐵蛋白的具體臨床應用案例。

4.1 替代治療

轉(zhuǎn)鐵蛋白是人血漿中的鐵轉(zhuǎn)運蛋白，對于遺傳性轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥[clinicaltrials. gov (NCT01797055)]需要輸入人血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白來進行替代治療[29]。遺傳性轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥在全球極為罕見，目前只有少數(shù)病例報道，采用血漿純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白進行注射治療，結(jié)果血紅蛋白和紅細胞都有增加，患者身體發(fā)展和精神狀態(tài)都有改善。荷蘭Sanquin 血液制品公司的轉(zhuǎn)鐵蛋白2010年開始進行臨床Ⅰ期實驗，用于治療遺傳性轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥。

4.2 鐵結(jié)合/調(diào)節(jié)治療

當體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白處于超載時，體內(nèi)游離的鐵能夠催化產(chǎn)生活性氧自由基，而活性氧自由基則會導致機體腎臟、肝臟以及粘膜損傷等。同時，游離鐵是細菌和真菌生長所需的元素，游離鐵過多會增加致病菌的感染幾率。在鐵結(jié)合及調(diào)節(jié)治療領域，轉(zhuǎn)鐵蛋白的治療原理主要基于以上兩點，在缺血再灌注損傷[ischemia-reperfusion injury(I/R)損傷]、β-地中海貧血、干細胞移植、化療等方面有著重要的應用[47]。

表2 人轉(zhuǎn)鐵蛋白的臨床應用Table 2 Clinical applications of human transferrin.

缺血再灌注損傷(I/R損傷)，是指在組織缺血基礎上恢復血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象。重新灌注血流會導致較大的氧化壓力，非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的游離鐵會催化產(chǎn)生自由基，這些自由基會導致細胞損傷和紊亂，從而激發(fā)I/R損傷，人大腦、心臟、腎臟和肝臟等對I/R損傷非常敏感[30]?？茖W家們在相關(guān)疾病的動物模型上也做了大量的工作。2004年De Vries等[31]首先在腎臟I/R損傷的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白注入可以有效地減緩腎臟損傷。2009年，Monbaliu等[32]在豬肝臟移植(患有I/R損傷)的模型中注入轉(zhuǎn)鐵蛋白發(fā)現(xiàn)，移植后原發(fā)性移植無功能的發(fā)生率高，通過靜脈注射轉(zhuǎn)鐵蛋白，輔助其他抗炎和保肝藥物治療，能夠有效保護受損的肝臟，避免移植后出現(xiàn)肝原發(fā)性無功能，促進移植肝功能的修復。2014年，一項臨床試驗研究將含有脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的聯(lián)合藥物用于減緩肝臟移植后的I/R損傷，目前正處于臨床Ⅱ期[clinicaltrials.gov (NCT02251041)]。

β-地中海貧血是由β-球蛋白的基因突變導致β-球蛋白合成減少，從而引起無效血紅蛋白的合成以及肝殺菌肽的低表達，導致腸道鐵吸收增加和鐵超載。在小鼠的β-地中海貧血的模型中發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白的注射，鐵代謝紊亂明顯改善，穩(wěn)定了血漿鐵離子濃度和血紅細胞的存活率，增加了肝殺菌肽表達，紅細胞更新速率加快[33～35]。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)鐵蛋白在小鼠地中海貧血癥中起著關(guān)鍵作用，因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白未來很有希望用于治療人β-地中海貧血。

干細胞移植和化療后的病人轉(zhuǎn)鐵蛋白水平降低，總血清鐵含量降低，非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的游離鐵含量升高，而游離鐵升高與移植后的死亡率有一定的相關(guān)[36]，Parkkinen和von Bonsdorff等在此方面做了大量的臨床研究[37～39]，這些研究表明，脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白在對干細胞移植后鐵結(jié)合有明顯的效果，轉(zhuǎn)鐵蛋白水平和總血清鐵含量升高，非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵含量降低，可以阻止葡萄球菌的生長，保護機體免受致病菌的感染。同時，臨床研究發(fā)現(xiàn)，對血管內(nèi)反復注入大劑量的脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白是非常安全的，最大劑量可達115 mg/kg體重。同種異體的干細胞移植會導致肝臟鐵累積，導致移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease GVHD)。Bairs等[40]在GVHD的小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的注入可以有效減緩肝臟中的鐵累積，阻止肝臟損傷和凋亡。

4.3 藥物載體

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通常在癌癥和腫瘤細胞表面有著高水平的表達，利用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物載體，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的特異性識別，可以將藥物靶向地運輸?shù)桨┘毎湍[瘤細胞表面，進行特異性地殺傷。因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白的另一個重要臨床應用是可作為藥物、毒素偶聯(lián)物、siRNA復合物以及融合體系的靶標分子，進行藥物的靶向運輸[41～47]。其中有代表的臨床案例是白喉毒素(CRM107)與轉(zhuǎn)鐵蛋白的偶聯(lián)藥物，用于治療惡性腦腫瘤，雖然在臨床Ⅰ期和Ⅱ期，該偶聯(lián)藥物相比于傳統(tǒng)治療方法展現(xiàn)出更好的抗癌效果，但在臨床Ⅲ期由于遠遠未達到預期效果而停止[41]。另外一個正在進行臨床Ⅱ期的案例是轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)到含抗腫瘤藥奧沙利鉑脂質(zhì)體納米顆粒，用于治療胃癌[clinicaltrials.gov (NCT00964080)]。這一系列的研究表明轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物載體在癌癥治療領域具有非常廣泛的應用前景。

5 展望

人血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白作為體內(nèi)最主要的鐵轉(zhuǎn)運載體，在鐵代謝中起著關(guān)鍵作用，對維護機體健康有著重要的意義。臨床應用方面，轉(zhuǎn)鐵蛋白展現(xiàn)出良好的應用前景。在鐵結(jié)合治療領域，相比于小分子鐵螯合劑，轉(zhuǎn)鐵蛋白作為干細胞移植后的鐵結(jié)合治療藥物，在預防細菌和真菌感染方面有著無法比擬的優(yōu)勢。在治療缺血再灌注損傷和β-地中海貧血顯現(xiàn)出良好的治療效果。同時，轉(zhuǎn)鐵蛋白可作為藥物載體，靶向進行藥物的定向輸送，在癌癥領域展現(xiàn)出越來越廣泛的應用前景。在國內(nèi)血液制品低溫乙醇法生產(chǎn)工藝中，人轉(zhuǎn)鐵蛋白主要集中在組分FIV沉淀中，而目前國內(nèi)廠家這部分沉淀直接當廢棄物處理，因此，從沉淀中分離純化出人轉(zhuǎn)鐵蛋白，加速新型血液制品人轉(zhuǎn)鐵蛋白的開發(fā)將具有重大的臨床意義和應用前景。