王婷婷, 趙鵬翔, 謝 飛

北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院, 北京氫分子研究中心, 北京 100124

黃芩在我國藥用歷史悠久，產量大且用途廣泛，其中主要的有效成分為以下4種：黃芩苷、黃芩素(baicalein)、漢黃芩苷(wogonoside)、漢黃芩素(wogonin)。在我國現(xiàn)行藥典當中，是以黃芩苷含量的高低來作為評價黃芩質量的標準。黃芩苷屬于黃酮類化合物(圖1)，黃酮類化合物的抗氧化作用已被人們所熟知。此外，黃芩苷口服后需經(jīng)過腸道中的酶水解在體內代謝為黃芩素來發(fā)揮藥效，故通常二者在一起進行研究。以往對于黃芩苷的認識只局限于清熱解毒、降壓、抗病毒等方面的作用，隨著近年來國內外對其研究的深入，發(fā)現(xiàn)黃芩苷還具有抗腫瘤等方面的作用[1]，通過大量的實驗結果表明，黃芩苷會以時間、濃度依賴的方式對胃癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細胞起到明顯的抑制效果。本文將針對近年來黃芩苷的抗腫瘤作用進行總結，以期為黃芩苷在腫瘤治療中的應用研究提供參考。

1 黃芩苷對腫瘤細胞的直接作用

當今多數(shù)直接與腫瘤細胞發(fā)生作用的抗腫瘤藥物主要是以下幾種方式：通過影響細胞周期來抑制腫瘤細胞的增殖；誘導腫瘤細胞凋亡相關的基因或蛋白發(fā)生改變以促進其凋亡；抑制腫瘤細胞的轉移能力。大量的實驗結果表明，黃芩苷可對腫瘤細胞造成多方面的綜合影響。

圖1 黃芩苷結構簡式Fig.1 Simplified structure of baicalin.

1.1 通過細胞周期阻滯抑制腫瘤細胞增殖

細胞周期是一個從遺傳物質準備到細胞分裂都受到嚴密管理的進程，從上一次細胞分裂結束開始到下一次細胞分裂結束被稱為一個細胞周期，分為G0/G1、S、G2、M四個時期，其中含有多個檢查點以確保遺傳物質的完整復制和在分裂過程中被精確分配到兩個子細胞當中。細胞周期的調控由細胞周期蛋白(Cyclin)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)三者共同協(xié)調完成。Cyclin分為多種類型，其中CyclinD作用于G1期，是啟動整個細胞周期循環(huán)的關鍵，可推動細胞周期進入S期(圖2)。Cyclin含有一段共同的保守氨基酸序列，通常與CDK結合形成Cyclin-CDK復合體發(fā)揮調控作用。異常的細胞周期活動是腫瘤細胞的特點之一，在絕大多數(shù)腫瘤細胞中許多Cyclin存在著異常激活的情況，特別是D型Cyclin和E型Cyclin，同樣CDKs也存在異常激活[2]。在轉基因小鼠中，過表達Cyclin后會誘導腫瘤發(fā)生。而CKIs是細胞周期的負調控因子，具有抗腫瘤的特性，包括CIP/KIP家族，例如：p21CIP1、p27KIP1、p57KIP2等，可抑制CDK1、CDK2的活性；INK4蛋白家族，例如：p16INK4A、p15INK4B、p18INK4C等，可與CDK4、CDK6結合并抑制其活性[3]。Cyclin、CDKs、CKIs這三者均可作為癌癥治療中的潛在靶點，對不受控的細胞周期進行調節(jié)，以抑制腫瘤細胞的過度增殖。

在肺癌的研究中，黃芩苷對人肺癌A549、SK-LU-1、SK-MES-1三種細胞具有選擇毒性，并且對正常人肺纖維母細胞無明顯影響，其中，黃芩苷可使A549細胞中的CyclinA表達量下降，將細胞周期阻滯在S期，而在SK-LU-1、SK-MES-1中則會使CyclinD1表達量下降，將細胞周期阻滯在G1期[4]。此外，還有報道稱黃芩素對于膀胱癌TSGH8301、BFTC905兩種細胞可通過抑制CDC2-CyclinB1復合物的活性來抑制膀胱癌細胞增殖[5]。CDC2，屬于CDKs，是細胞周期調控中的關鍵蛋白， Wall 等[6]在乳腺癌細胞MCF-7和宮頸癌細胞HeLa中發(fā)現(xiàn)，CDC2可抑制凋亡抑制蛋白的磷酸化作用，以促進腫瘤細胞凋亡。此外，在黃芩苷對細胞周期的調控中有多條信號通路參與其中，例如PI3K/AKT、JAK-STAT等。黃芩苷對人胃癌SGC-7901細胞具有抑制作用，可上調ptenmRNA水平以及蛋白表達[7]，其中發(fā)揮抑制作用的潛在機制可能與PI3K/AKT信號途徑有關。pten是一種腫瘤抑制基因，PTEN蛋白非常特殊，同時具有脂質磷酸酶、蛋白磷酸酶兩種活性，可以上調細胞周期依賴蛋白激酶抑制蛋白p27，降低PI3K的水平并抑制其下游Akt的活性[8],PI3K/AKT信號途徑在多種癌癥中存在著過度激活的現(xiàn)象，會導致細胞周期失控與細胞凋亡抑制。同時有實驗證據(jù)表明黃芩素可抑制PI3K的活性[9]，并使食管鱗狀腫瘤細胞中p-Akt的表達量減少[10]。此外，董明等[11]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可能是通過下調CyclinD1與上調凋亡相關蛋白的表達量，來起到對人肝癌細胞SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤的生長抑制作用。同時在SMMC-7721體外實驗當中，黃芩苷對于STAT3的磷酸化具有抑制作用并可下調其表達量，可能是通過JAK-STAT這條信號通路對SMMC-7721細胞起到抑制效果[12]。JAK-STAT信號途徑具有促進細胞進入細胞周期、抑制細胞凋亡等作用。STAT家族是信號激活與轉導過程中的關鍵因子，在細胞生長增殖、凋亡中起著關鍵作用，可促使帶有酪氨酸的蛋白發(fā)生磷酸化，引發(fā)一系列的級聯(lián)反應[13]。其中STAT3與腫瘤細胞密切相關，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中均發(fā)現(xiàn)STAT3存在異常激活的情況，可對CyclinD1/D2、Bcl2、VEGF進行異常調節(jié)，是腫瘤細胞惡性進程當中的驅動器[14]。

1.2 誘導腫瘤細胞凋亡

研究表明，細胞凋亡主要分為兩大途徑：外在途徑(死亡受體途徑)和內在途徑(線粒體途徑)。細胞凋亡的機制是高度復雜的，涉及諸多分子的級聯(lián)反應。死亡受體途徑主要由細胞表面的死亡受體Fas、腫瘤壞死因子受體TNFR等所介導，當死亡配體與之結合后，引起細胞凋亡。通過線粒體途徑發(fā)生的凋亡則會導致線粒體膜電位發(fā)生改變，與凋亡相關的因子或蛋白釋放，例如細胞色素c(Cytochrome c)等，從而引發(fā)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族發(fā)生一系列級聯(lián)反應。Caspase家族是執(zhí)行絕大多數(shù)細胞凋亡的最終途徑，其中Caspase-3位于關鍵地位。兩大凋亡途徑不是相互獨立的，可相互關聯(lián)，均可由Caspase-3來執(zhí)行凋亡，Caspase-3經(jīng)剪切活化后會導致DNA片段斷裂和蛋白質降解等，形成凋亡小體后被吞噬細胞吞噬[15,16]。此外，在細胞凋亡中還存在內質網(wǎng)介導的凋亡途徑，內質網(wǎng)可參與調節(jié)細胞內的Ca2+的動態(tài)平衡，當內質網(wǎng)發(fā)生應激，Ca2+平衡被破壞時可激活位于其上的Caspase-12，Caspase-12可引發(fā)細胞凋亡或進一步激活Caspase-3發(fā)揮凋亡作用(圖3)[16]。

圖2 黃芩苷在細胞周期調控中的作用位點Fig.2 The acting sites of baicalin in cell cycle regulation.注:B:Baicalin

在T型急性淋巴白血病CCRF-CEM細胞中，黃芩苷除可使DNA斷裂、細胞周期發(fā)生阻滯外，還可下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進線粒體釋放細胞色素c，同時線粒體膜電位發(fā)生改變，表明在黃芩苷促進CCRF-CEM發(fā)生細胞凋亡過程中有線粒體途徑參與其中[17]。在白血病HL-60細胞中，黃芩苷同樣可以下調Bcl-2的表達量并改變線粒體膜電位，另外還會提高細胞中的Ca2+水平[18]。Ca2+穩(wěn)態(tài)被破壞后則會導致內質網(wǎng)應激，在實驗后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷還可上調Caspase-3、Gadd153的表達水平，在正常細胞中Gadd153通常水平較低，但在應激條件下會呈現(xiàn)高表達的情況，可作為檢測內質網(wǎng)應激水平的標志物。此外，細胞凋亡的死亡受體途徑也同樣參與到黃芩苷對腫瘤細胞的抑制作用中，Chen等[19]研究表明，黃芩苷處理胃癌MGC-803、BGC-823之后，相關的凋亡誘導配體(TRAIL)與FASL、凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3與Caspase-8的mRNA及蛋白的表達水平均會上調。除此之外，黃芩苷還可下調骨肉瘤MG-63細胞中Survivin的表達量并抑制新血管形成從而促進其凋亡，Survivin作為凋亡抑制蛋白(IAP家族)中的一員，同樣也是目前癌癥治療研究中較為火熱的作用靶點，可直接抑制Caspase-3、Caspase-7發(fā)揮其凋亡作用[20]。

1.3 抑制腫瘤細胞的侵襲與遷移

腫瘤細胞的侵襲與轉移是其惡性進程當中重要的一步，首先要對腫瘤細胞周圍的細胞外基質進行降解，此過程中基質金屬蛋白酶家族(mitochondrial membrane potential,MMPs)發(fā)揮著重要作用,同時MMPs還具有抑制腫瘤新血管形成與調節(jié)細胞黏附性等多種作用[21]，其中MMP-2和MMP-9兩個亞型尤為關鍵(表1)。張悅等[30]發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌HeLa細胞中，黃芩苷通過p38-MAPK信號通路下調MMP-2、MMP-9的表達量來抑制其侵襲，在一定程度內呈現(xiàn)濃度依賴效應。有絲分裂原活性蛋白激酶(mitogen activated prote in kinase,MAPKs)屬于一大類保守蛋白家族，位于細胞質基質，活化后可以使一系列核蛋白磷酸化或進入細胞核內激活特定靶基因， p38-MAPK信號通路主要影響細胞增殖和遷移等方面，在膀胱癌細胞HTB9、HTB5中，發(fā)現(xiàn)p38-MAPK信號通路下游因子MAPK活化蛋白激酶2(MAPKAPK2)可以影響MMP-2、MMP-9的表達來調節(jié)細胞遷移[31]。

另外，有實驗研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷使人卵巢癌SKOV3細胞中p-ERK、波形蛋白(Vimentin)的表達量下降，對細胞侵襲的抑制作用的潛在機制可能是以下2種：影響MAPK-ERK信號通路與上皮間充質轉化(EMT)[32]。細胞外信號調節(jié)激酶(external signal regulated kinase,ERK)同樣屬于MAPK蛋白家族分為兩種亞型ERK-1與ERK-2，在細胞調控中起著關鍵作用，通過Ras-Raf-MEK-ERK(簡稱ERK通路)發(fā)揮作用。Ras，一種GTP結合蛋白位于細胞膜內側，當受到胞外信號刺激后，可使Raf、MEK、ERK產生磷酸化的級聯(lián)反應來發(fā)揮調節(jié)作用，ERK信號通路與人類惡性腫瘤密切相關，在卵巢癌、胃癌等細胞中普遍存在ERK持續(xù)激活的現(xiàn)象[33]，孔衛(wèi)平等[34]研究發(fā)現(xiàn)在正常子宮內膜組織中ERK-1、p-ERK-1陽性率約為12.5%、18.75%，而在子宮內膜癌組織中的陽性率分別高達78.33%、68.33%。同時，有大量實驗表明，阻斷ERK途徑可起到抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的作用,地塞米松、巨噬細胞移動抑制因子(migratory inhibitorg factor,MIF)對膠質瘤U373-MG細胞遷移和侵襲的影響均是通過抑制或激活ERK途徑來實現(xiàn)的[35]。前文提到黃芩苷對人卵巢癌SKOV3細胞遷移、侵襲的抑制還可能影響了EMT過程，該過程多見于腫瘤細胞或處于特定生理情況下的細胞中，對于上皮源腫瘤細胞的轉移、浸潤等過程至關重要。2種主要原因可導致腫瘤細胞中出現(xiàn)EMT，例如：受到炎性細胞因子刺激和缺氧條件下的活性氧造成的損傷[36]。EMT過程中牽涉的信號通路包括：TGF-β、Wnt、Notch等，可破壞細胞間的黏附、使細胞失去極性、重塑細胞骨架等[37]，使上皮細胞向間質細胞進行轉化，從而實現(xiàn)腫瘤細胞的轉移與浸潤,并且EMT可促使MMPs高表達。Chung等[38]在實驗中同樣發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可抑制乳腺癌細胞的EMT過程。另外，Wang等[39]實驗發(fā)現(xiàn)，黃芩苷通過下調EMT過程中的多個間質細胞標志物的表達量來抑制骨肉瘤細胞的侵襲。其中，波形蛋白作為EMT過程中間質細胞的標志物被廣泛研究，其中絕大多數(shù)與腫瘤細胞的遷移與侵襲有關。Vimentin可改變細胞形狀、增加細胞運動活力，并在多種癌癥中高表達[40]，高轉移潛能的腫瘤細胞中Vimentin會呈現(xiàn)高表達，當藥物使Vimentin表達量下降之后，均可不同程度地抑制遷移與侵襲。

圖3 黃芩苷在腫瘤細胞凋亡中的作用位點Fig.3 The acting sites of baicalin in tumor cell apoptosis.注:B:Baicalin

MMPs激活/上調抑制/下調MMP-2MMP-2前體被MTI-MMP激活后會促進纖維肉瘤HT-1080細胞發(fā)生侵襲[22]在小鼠黑色素瘤B16-BL6細胞中,DDR2抑制MMP-2的表達后可經(jīng)ERK/NF-κB信號途徑抑制細胞的遷移與侵襲 [23]膀胱癌細胞的轉移性與MMP-2蛋白的高表達有關[24]在人肺癌A549細胞中,抑制MMP-2后可抑制其新血管形成[25]MMP-9過表達MMP-9后可增強乳腺癌MDA-MB-231細胞、纖維肉瘤HT-1080細胞的浸潤性[26]抑制MMP-9后可抑制成神經(jīng)管細胞瘤DAOY細胞的生長[27]在軟骨肉瘤JJ012細胞中,激活MMP-9后可經(jīng)FAK、MEK、ERK、NF-κB等信號轉導途徑促進細胞遷移 [28]在膠質瘤SNB19細胞中,降低MMP-9的表達后可抑制其細胞生長、降低浸潤性并且抑制腫瘤血管形成[29]

2 黃芩苷對腫瘤細胞的間接作用

在眾多的抗腫瘤藥物中，除前文介紹的能夠直接與腫瘤細胞發(fā)生作用的藥物外，還有些可間接地起到抑制腫瘤細胞的作用。已有大量的文獻報道，當機體內氧化應激水平持續(xù)升高或處于長期慢性炎癥中，會大大增加癌癥發(fā)生的機率或促進腫瘤細胞的生成與轉移。

2.1 黃芩苷的抗氧化作用

正常情況下，人體內氧化與抗氧化是一個相對平衡的狀態(tài)，當這種平衡被破壞后會導致大量問題，例如：DNA損傷、促進細胞內發(fā)生脂質過氧化反應導致細胞膜滲透性與流動性的改變等[41]。另外，從遺傳學、能量代謝等方面的研究來看，腫瘤患者處于一個低抗氧化狀態(tài)，并且體內會存在活性氧(reactive oxygen species,ROS)的堆積，其中包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)等，另外ROS還參與腫瘤細胞的生成與轉移[42]。目前，很多抗腫瘤藥物是通過改變人體內氧化應激水平來起到對腫瘤細胞的抑制作用的。

從中草藥中提取出的黃酮類化合物被研究證明是一種非常有效的抗氧化劑，與其分子結構中的酚羥基密切相關[43]，黃芩苷中含有2個酚羥基，因此具有較強的抗氧化作用。大腦組織易受到氧化應激損傷，因為神經(jīng)元存在豐富的多不飽和脂肪酸，并且內源性抗氧化酶不足[41]，ROS對神經(jīng)元細胞損傷極大。Gao等[44]通過電子自旋共振ESR實驗發(fā)現(xiàn)，黃芩苷和黃芩素可以以濃度依賴的方式清除羥自由基(·OH)，并且10 μmol/L的黃芩苷可依靠其羥基基團來緩解大鼠大腦皮層的氧化應激損傷，效果比已知的抗氧化劑槲皮黃酮更強。譚廷華等[45]還采用熒光法檢測了黃芩甙，發(fā)現(xiàn)其對芬頓(Fenton)反應(Fe2++H2O2→Fe3++OH+·OH)所產生的羥自由基(·OH)有著非常強的清除作用，EC50=39 μmol/L，清除效果比其特異性清除劑甘露醇更加顯著。Fenton反應是由法國科學家Fenton發(fā)現(xiàn)的，因該反應可產生具有強氧化性的·OH，常被用來降解污染，但在生物學中可用來研究細胞氧化應激的機理與修復。Cao等[46]的研究結果表明黃芩苷通過抗氧化以及抗凋亡兩種方式減弱缺血再灌注后對神經(jīng)元細胞造成的損傷，損傷的主要原因之一是重新得到血液灌注后短時間內產生大量氧自由基O2-、·OH等。進一步對海馬組織檢測發(fā)現(xiàn),其作用的機理是:黃芩苷可降低脂質過氧化反應的終產物——丙二醛(MDA)的含量，從而可間接反映出自由基含量的多少。提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)等活性來清除氧自由基，保護機體免受自由基損傷，同時促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，并且抑制細胞凋亡蛋白(Caspase-3)的表達。在大鼠神經(jīng)細胞PC-12中同樣發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可增強SOD活性，降低細胞中MDA含量，并且通過抗細胞凋亡的方式來減輕H2O2帶來的氧化損傷[47]。

2.2 黃芩苷的抗炎作用

當人體受到外界環(huán)境刺激時，免疫系統(tǒng)易遭到破壞，存在一定機率引發(fā)機體內產生炎性反應，如果炎性不能被及時清除，更多的炎性細胞會轉移至病灶形成正反饋的惡性循環(huán)，對機體造成損傷，嚴重時會造成DNA損傷、基因組不穩(wěn)定等問題。因此炎癥與癌癥的關系密切，有調查顯示慢性炎癥與1/4以上的癌癥發(fā)生相關[48]。另外，從細胞所處的微環(huán)境來看，腫瘤細胞和炎性細胞的微環(huán)境之間可相互作用，腫瘤細胞可通過炎性細胞獲取營養(yǎng)因子以促進其生長。炎性微環(huán)境中的炎性細胞因子、組胺等可增強血管壁、淋巴管壁的通透性，使腫瘤細胞更容易穿過血管壁進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進而促進腫瘤細胞轉移。同時，炎性細胞還可以釋放出大量的活性氧[49,50]，在本文中已提到活性氧與腫瘤細胞的發(fā)生、轉移同樣密切相關。因此炎癥與腫瘤細胞的關系為癌癥治療研究提供了新的思路。消除炎性反應可從以下三方面入手：抑制炎性反應相關酶的酶活性；抑制炎性相關基因的表達；抑制多種炎性因子的產生與釋放。其中NF-κB是參與調控炎性反應的關鍵因子(圖4)。NF-κB包括兩大家族，這兩個家族多以二聚體形式結合(p50/p65)，形成具有生理活性的NF-κB，通常NF-κB在細胞質中與IκB(NF-κB抑制蛋白)形成復合物處于靜息狀態(tài)，磷酸化后與IκB脫離進入細胞核，促進炎性因子TNF、IL-6等靶基因轉錄，引發(fā)炎癥反應[51]。同時越來越多的實驗證據(jù)表明，NF-κB在腫瘤細胞的生成過程中同樣具有一定的作用，NF-κB信號通路可參與調控細胞周期、抑制凋亡等[52]，NF-κB相當于炎性反應與癌癥之間的橋梁。另外，轉錄因子STAT3也同時參與了炎性反應與癌癥的調控。STAT3信號通路主要靠IL-6家族、IL-10家族以及一些酪氨酸激酶等激活，激活后可進一步誘導表達炎性因子，加劇炎性反應[50]，STAT3與NF-κB還可發(fā)生相互作用[53]，而在被Janus家族激酶(JAK)激活后，JAK-STAT3信號通路對腫瘤細胞周期的調控在前文中已闡述。

在乳腺炎動物模型中，黃芩苷可降低炎性因子IL-6、TNF-α的含量，同時下調NF-κB、p38的mRNA表達水平并降低其磷酸化水平，通過抑制NF-κB信號通路和MAPK-p38信號通路來發(fā)揮抗炎作用，后者同樣是炎性反應中重要的調控途徑[51,54]。同時還有報道發(fā)現(xiàn)，黃芩可通過影響STAT3通路來減少炎性因子的含量[55]。2000年Li等[56]首次提出，黃芩苷可與部分趨化因子結合來發(fā)揮抗炎作用，趨化因子是一些低分子量的小蛋白質，可導致白細胞定向遷移至炎性病灶。在人白細胞中黃芩苷可抑制趨化因子與其特異性受體結合，進一步檢測發(fā)現(xiàn)黃芩苷與趨化因子并不是競爭受體，而是直接與趨化因子結合，這種結合是具有選擇性的，IL-8、MIP-1β、MCP-2等均可被黃芩苷結合，但是與CX3C發(fā)生相互作用。將黃芩苷與IL-8共同注射入大鼠體內，由IL-8引起的中性粒細胞浸潤(炎性反應特征之一)明顯地受到抑制。除此之外， Luo等[57]通過實驗發(fā)現(xiàn)，加入黃芩苷后可通過負調控TLR信號途徑來緩解炎性反應。TLR信號通路可被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)為革蘭氏陰性菌細胞壁外側的一類物質激活，不僅可以引起多種細胞一系列的由內毒素誘導的炎性反應，還可以引起非細菌性的炎性反應，Toll樣受體(TLR)屬于跨膜蛋白，可識別多種細胞內、外源性配體，通過級聯(lián)活化反應參與多種細胞調控[58]。Feng等[59]的研究結果還表明，黃芩苷可以通過下調TLR4(LPS的作用靶點)的表達來抑制炎性反應。

圖4 黃芩苷在炎性反應調控中的作用位點Fig.4 The acting sites of baicalin in the regulation of inflammatory response.注:B:Baicalin; P:磷酸化

3 展望

黃芩在傳統(tǒng)中醫(yī)中藥用歷史久遠，黃芩苷作為黃芩中最主要的有效成分之一，過去認為其主要作用是清熱解毒、瀉火等。隨著國內外對黃芩苷的研究及其發(fā)揮藥效的潛在分子機制的了解逐步深入，研究者們認識到黃芩苷的藥效十分廣泛。近年來，大量的文獻報道稱黃芩苷可從諸多方面對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，并且對正常細胞無明顯毒副作用，為未來的癌癥治療提供了新的思路。但是，目前絕大多數(shù)黃芩苷對于腫瘤細胞的研究局限于細胞或動物實驗，對于其中的分子機制尚不完全清楚，同時在臨床研究上還有待進一步探究，評價其臨床應用的價值及可能性。