張毅，張東，陳斌，蔡冬冬，裴超信，李春

（四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

本研究對(duì)四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存的2014年簡(jiǎn)陽(yáng)小反芻獸疫病毒（PPRV）陽(yáng)性鼻拭子進(jìn)行了PPRV系統(tǒng)進(jìn)化分析，旨在對(duì)四川省2014年發(fā)生的PPR疫情進(jìn)行數(shù)據(jù)補(bǔ)充。

1 材料

1.1 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）試劑盒，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 PPRV陽(yáng)性材料 2014年從四川簡(jiǎn)陽(yáng)地區(qū)采集羊鼻拭子1份，經(jīng)熒光RT-PCR確定為PPRV陽(yáng)性，由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室于-80℃保存。

1.3 引物 參照文獻(xiàn)[1]合成引物，用于N基因擴(kuò)增。目的片段預(yù)期長(zhǎng)度為1845bp，擴(kuò)增引物NF：5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGA-3'，N-R：5'-CAGCCCCTTGTTGACATGGTAT-3'。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

2 方法

2.1 PPRV SCJY株N基因的擴(kuò)增和序列測(cè)定

2.1.1 核酸提取 將鼻拭子以9 100 r/min離心2min，取上清液，按照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒RNA，-20℃保存待用。

2.1.2 RT-PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定 取5 μL病毒RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書配制50 μL反應(yīng)體系，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：50℃ 30min，94℃ 5 min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 90s，循環(huán) 35 次；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，送生工生物工程（上海）有限公司克隆、測(cè)序。

2.2 PPRV基因組序列分析 從GenBank獲取PPRV代表毒株N基因序列15條，通過(guò)DNASTAR軟件，采用Clustal W方法進(jìn)行N基因核苷酸比對(duì)和氨基酸比對(duì)；通過(guò)MEGA6軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建N基因進(jìn)化樹，Bootstrap值為1000。

3 結(jié)果

3.1 PPRV SCJY株N基因的擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：擴(kuò)增出約1.8kb條帶，與目的片段大小相同（圖1）。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序成功，序列全長(zhǎng)1845bp。

3.2 PPRV SCJY株N基因的同源性分析結(jié)果 將SCJY株與15條參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，參考序列信息見表1。16株P(guān)PRV N基因的長(zhǎng)度均為1578nt。同源性分析結(jié)果（圖2）表明，16個(gè)PPRV毒株N基因的核苷酸同源性介于88.8%～100%之間，其中SCJY株與新疆株XJYL2013的同源性最高（100%），與烏干達(dá)株Uganda 2012的同源性最低（88.9%），與疫苗株Nigeria75/1的同源性為93.6%；N蛋白氨基酸比對(duì)結(jié)果（圖3）表明，16個(gè)PPRV毒株N蛋白的同源性介于92.8%～100%之間，其中SCJY株與新疆株XJYL2013、河南株CH/HNNY/2014的同源性最高（100%），與烏干達(dá)株Uganda 2012、阿聯(lián)酋株UAE 1986的同源性最低（92.8%），與疫苗株Nigeria75/1的同源性為94.9%。

圖1 SCJY株N基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表1 SCJY株及參考毒株的信息表

3.3 PPRV SCJY株N基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果 SCJY株與參考株的N基因核苷酸Neighbor-Joining進(jìn)化樹見圖4。如圖所示，16株P(guān)PRV的N基因形成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個(gè)譜系：塞內(nèi)加爾E32株構(gòu)成Ⅰ系，尼日利亞疫苗株Nigeria/75/1和加納株Ghana/NK1/2010構(gòu)成Ⅱ系；阿聯(lián)酋株UAE 1986、埃塞俄比亞株Ethiopia 1994、蘇丹株MIELIK_72、烏干達(dá)株Uganda 2012構(gòu)成Ⅲ系；SCJY株和其他4個(gè)中國(guó)株（河南、新疆、北京、西藏）的遺傳距離最近，這5個(gè)中國(guó)株與土耳其株、摩洛哥株、2個(gè)印度株構(gòu)成Ⅳ系。

圖2 16株P(guān)PRV N基因的核苷酸同源率

圖3 16株P(guān)PRV N蛋白的氨基酸同源率

圖4 16株P(guān)PRV N基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

4 討論

根據(jù)N基因序列，世界范圍內(nèi)的PPRV毒株可以分為4個(gè)譜系[1]，各型具有明顯的地域特征，Ⅰ系主要是西非（科特迪瓦、塞內(nèi)加爾和幾內(nèi)亞）毒株，Ⅱ系主要是加納、尼日利亞和馬里毒株，Ⅲ系主要是東非（埃塞俄比亞和蘇丹）和阿拉伯半島南部（阿曼和阿聯(lián)酋）毒株，Ⅳ系主要是亞洲毒株，包括中國(guó)、土耳其、以色列、沙特阿拉伯和印度等，本研究的分型結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道類似。本研究中的SCJY株屬于Ⅳ系，其N基因與新疆株的同源性達(dá)到100%，與同時(shí)期國(guó)內(nèi)流行毒株的同源性也在99%以上，表明SCJY株與2013～2014年我國(guó)發(fā)生的PPRV主要毒株相同，該毒株進(jìn)入國(guó)境后迅速傳播到不同地區(qū)，尚未在各地區(qū)開始基因組演化。

目前，尼日利亞株Nigeria/75/1是OIE唯一允許使用的疫苗株，臨床免疫保護(hù)效果好[2-3]，免疫保護(hù)期長(zhǎng)，能滿足現(xiàn)階段預(yù)防PPR的需求。然而，Nigeria/75/1是弱毒疫苗，在進(jìn)化關(guān)系上又與我國(guó)流行株分屬不同的基因型，在疫苗免疫壓力下，本地毒株會(huì)不會(huì)發(fā)生突變、重組等演化，從而導(dǎo)致新毒株產(chǎn)生，進(jìn)而引起免疫失?。渴翘貏e需要關(guān)注的問(wèn)題。因此，臨床上除對(duì)疫苗免疫抗體實(shí)施定期監(jiān)測(cè)[4-5]外，還需加強(qiáng)對(duì)PPRV病原的監(jiān)測(cè)力度，進(jìn)一步開展病毒攜帶率、發(fā)病病例的分子生物學(xué)分析等研究。