陳芊杏 段芳蕾 尹濤 周劍 李霞斌 劉云 胡佳佳 孫興旺

結(jié)直腸癌在中國居癌癥發(fā)病率第3位，死亡率第5位［1］。約1/2結(jié)直腸癌患者存在RAS基因突變，其在人體內(nèi)有三種亞型，即KRAS、NRAS 及HRAS，其中KRAS基因突變最常見［2］。Moon等［3］報道KRAS基因突變可激活Wnt/β-Catenin 信號通路促進腫瘤發(fā)生。SETDB1（set domain bifurcated 1）是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，Kim 等［4］報道SETDB1 通過Wnt/β-catenin 通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)生。但結(jié)直腸癌中KRAS 基因突變與SETDB1是否存在相關(guān)性，目前仍不清楚。本研究初步探討了SETDB1在KRAS基因突變型結(jié)直腸癌中的表達情況及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以期為研究結(jié)直腸癌的發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年1月至2017年12月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院接受診治的159 例結(jié)直腸癌患者的癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣>5 cm 處）標本以及臨床資料。納入標準：1）經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診結(jié)直腸癌；2）術(shù)前未行新輔助治療；3）臨床病例資料完整；4）患者或其家屬知情同意。排除標準：1）除結(jié)直腸癌以外，同時合并其他器官腫瘤病史；2）臨床病例資料缺失。根據(jù)上述標準，共122例納入研究。本研究通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床試驗倫理委員會批準（編號：KY2019061）。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 組織DNA 提純試劑盒QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit（購自德國Qia?gen公司）；DNA 擴增文庫Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0、Ion PIT?MTemplate OT2 Kit v3、Ion PITMHi-QTMSequencing 200 Kit（美國Life Technologies公司）；Nuclease?Free Water（美國Life Technologies公司）；DA8600基因測序儀（中山大學(xué)達安基因股份有限公司提供）；SETDB1鼠抗人抗體（美國Bioworlde公司）；EDTA抗原修復(fù)液、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 基因檢測 分別取新鮮癌組織及癌旁組織50～100 mg 搗碎，按QIAamp?DNA 提取試劑盒說明書，提取DNA。采用Qubit 3.0熒光劑檢測DNA濃度，濃度在2 ng/mL 以上為合格。采用Ion AmpliSeqTMLi?brary Kit2.0 構(gòu)建文庫DNA。采用NGS 檢測技術(shù)，DA8600 高通量檢測儀進行KRAS 基因第2、3、4 外顯子檢測。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測及其結(jié)果判讀 石蠟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后4 μm 厚連續(xù)切片，采用EnVision免疫組織化學(xué)染色法染色：切片經(jīng)60℃恒溫烤箱烘烤過夜后二甲苯脫蠟、酒精脫水，PBS洗滌；于枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）中高壓修復(fù)3 min，冷卻至室溫后蒸餾水沖洗；滴加一抗SETDB1（1:100）室溫孵育4 h，PBS 洗滌后滴加二抗，室溫孵育30 min；PBS 洗滌后使用顯色劑DAB 顯色，顯微鏡下觀察，顯色完全后蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木精復(fù)染、稀鹽酸分化、飽和碳酸鋰反藍、脫水、透明、封片。

結(jié)果判讀：所有免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位主治醫(yī)師級別以上的病理科醫(yī)師獨立盲審，根據(jù)腫瘤細胞陽性比例、著色深度計分。評分標準：同一顯微鏡下計算腫瘤細胞陽性數(shù)，陽性細胞占腫瘤細胞的比例＜5%為0分，5%～30%為1分，31%～70%為2分，>70%為3分；按細胞著色深度評分，無著色0分，淡棕黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分［5］。上述兩項指標分數(shù)相加，0～2分為陰性，3～6分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用χ2檢驗分析KRAS 基因狀態(tài)、SETDB1 蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，其中分化程度為等級變量，采用秩和檢驗；采用Pearson 相關(guān)檢驗分析KRAS基因突變與SETDB1 表達的相關(guān)性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因檢測情況

本研究采用NGS 二代測序技術(shù)對122 例結(jié)直腸癌標本進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)122 例癌組織中51 例存在KRAS 基因突變，突變率為41.8%。KRAS 基因突變主要發(fā)生在第2、3、4號外顯子，其中2號外顯子突變46 例（90.2%）、3 號外顯子突變2 例（3.9%）、4 號外顯子突變3 例（5.9%），見表1。122 例癌旁組織中均未檢測到KRAS基因突變。

表1 122例結(jié)直腸癌組織標本中KRAS基因突變情況

2.2 KRAS基因狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

分析癌組織中KRAS基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示KRAS基因突變狀態(tài)與腫瘤部位、術(shù)前血清CEA水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤大小、pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 結(jié)直腸癌標本中SETDB1蛋白的表達

運用免疫組織化學(xué)法對122 例結(jié)直腸癌標本中SETDB1蛋白表達進行檢測，結(jié)果顯示SETDB1陽性反應(yīng)產(chǎn)物位于細胞質(zhì)及細胞質(zhì)伴細胞核，著棕黃色顆粒（圖1）。癌組織中SETDB1陽性99例，陽性表達率81.1%；癌旁組織中SETDB1 陽性36 例，陽性表達率29.5%。SETDB1在癌組織及癌旁組織中的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=65.813，P＜0.001），見表3。

表2 KRAS基因突變狀態(tài)及SETDB1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

圖1 免疫組織化學(xué)檢測SETDB1蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達

2.4 SETDB1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理學(xué)分析表明SETDB1 蛋白陽性表達與分化程度、腫瘤大小、術(shù)前血清CEA水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤部位、pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.5 KRAS 基因突變與SETDB1 蛋白表達的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，51例KRAS基因突變型的癌組織中，SETDB1陽性47例，陽性率92.2%；71例KRAS基因野生型的癌組織中，SETBD1陽性52例、陰性19例，陽性率73.2%。KRAS基因突變與SETDB1蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.232，P=0.008，表4）。其中，KRAS基因主要突變類型G12D、G13D、G12V與SETDB1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表5）。

表3 SETDB1蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達 例（%）

表4 KRAS基因突變狀態(tài)與SETDB1蛋白表達的相關(guān)性 例（%）

表5 KRAS 基因主要突變類型與SETDB1 蛋白表達的相關(guān)性 例（%）

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)生過程中會出現(xiàn)原癌基因激活、抑癌基因失活、DNA修復(fù)相關(guān)基因突變、凋亡調(diào)節(jié)紊亂等一系列生物學(xué)變化，KRAS基因突變是結(jié)直腸癌發(fā)生過程中常見的基因突變［6］。KRAS基因突變使RAS蛋白無需其上游信號EGFR的激活，而與GTP持續(xù)性結(jié)合，進而持續(xù)性刺激下游信號，最終促進腫瘤發(fā)生，影響患者預(yù)后［7］。這種致癌性的KRAS 基因突變，介導(dǎo)超過10 種不同的信號通路，包括MAPK 通路［8］、PI3K-AKT-MTOR通路［9］、Wnt/β-Catenin通路［3］等。然而，目前針對KRAS基因突變的靶向藥物尚在研發(fā)中，因此，探討KRAS 基因突變在結(jié)直腸癌中的作用機制及臨床意義仍非常重要。

本研究結(jié)果提示，KRAS基因在結(jié)直腸癌組織中的突變率為41.8%，右半結(jié)腸KRAS 基因突變率高于左半結(jié)腸。目前研究者普遍認為，左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌應(yīng)被視作不同的疾病。右半結(jié)腸分別起源于中胚層的后腸和中腸，右半結(jié)腸更可能出現(xiàn)CpG島甲基化和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及BRAF基因突變，而左半結(jié)腸更多的出現(xiàn)APC 基因、TP53 基因的突變［10-11］。因此，KRAS基因突變在左半結(jié)腸、右半結(jié)腸的差異，可能分別與其胚胎起源不同有關(guān)。本研究檢測到在結(jié)直腸癌中KRAS 基因突變與術(shù)前血清CEA 水平有關(guān)。CEA 被廣泛用于結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測及預(yù)后評估，它是由結(jié)腸、直腸組織產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白，在腫瘤發(fā)展中參與細胞間黏連［12］。Yoo 等［13］的研究中發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細胞中，CEA高水平表達與RAS基因的活化相關(guān)。本研究結(jié)果也提示KRAS 基因在術(shù)前血清CEA 陽性患者中突變率更高，表明術(shù)前血清CEA 水平高的患者可能預(yù)示著KRAS基因突變的存在，這種預(yù)測可能為指導(dǎo)患者的靶向治療提供幫助。

SETDB1是一種組蛋白H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶，其在肝癌、非小細胞肺癌、腎癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中高表達［14-16］。Sun等［17］研究表明，在非小細胞肺癌中SETDB1可通過調(diào)節(jié)WNT通路信號傳導(dǎo)促進腫瘤發(fā)生。Kim等［4］研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SETDB1可抑制Wnt/β-catenin通路信號傳導(dǎo)，進而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生。Moon等［3］報道KRAS基因突變后上調(diào)其下游ERK通路，進而激活Wnt/β-catenin通路信號傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞中的腫瘤干細胞標志物表達。KRAS基因及SETDB1均通過Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，然而，KRAS基因突變與SETDB1表達是否相關(guān)聯(lián)，目前鮮見相關(guān)報道。本研究顯示，KRAS基因突變與SETDB1蛋白表達呈正相關(guān)，兩者可能通過Wnt/βcatenin通路相互調(diào)節(jié)，其具體作用機制尚需進一步研究。二代測序結(jié)果表明KRAS基因主要突變類型為G12D（41.2%）、G13D（23.5%）、G12V（15.7%），SETDB1蛋白陽性表達可能與這些突變類型相關(guān)，本課題組下一步將擴大樣本量以進一步驗證統(tǒng)計分析結(jié)果。

本研究進一步分析了SETDB1 蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SETDB1蛋白陽性表達與分化程度、腫瘤大小、術(shù)前血清CEA 水平相關(guān)，提示SET?DB1 可能參與腫瘤的分化、增殖等。Beyer 等［18］的研究表明，SETBD1在細胞分化中起著重要作用。Chen等［19］研究表明，過表達SETDB1可促進結(jié)直腸癌細胞的增殖。SETDB1可能在結(jié)腸癌中起癌基因的作用，但目前仍需進一步研究以闡明其作用機制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示KRAS 基因突變與SETDB1蛋白相關(guān)，KRAS基因突變與SETDB1的具體作用方式需更多證據(jù)證明。本研究結(jié)果為結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機制提供了新的依據(jù)。