王明華

（遼寧省沈陽市肛腸醫(yī)院，遼寧 沈陽 110002）

中醫(yī)認為，慢性結腸炎主要是由濕寒之邪內侵臟腑所致運化失調，或濕熱中阻導致氣滯血瘀而引發(fā)的寒熱錯雜，病機是脾胃功能障礙，故治療的根本應是恢復、調和脾胃功能[1-2]。腸可寧微丸由黃芪、黃連、黃柏、白術、厚樸等中藥組方，為我院經(jīng)驗用方，有健脾益氣、清熱利濕、厚腸止瀉功效，對慢性結腸炎有較好療效[3-4]。為保證該制劑的質量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別制劑中的黃芪、黃柏，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中的鹽酸小檗堿含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；KQ118型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA1004A型電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司）；TGL-16型臺式離心機（湖南湘儀實驗儀器有限公司）。

試藥：腸可寧微丸（我院自制，批號分別為20180311，20180313，20180315，規(guī)格為每袋 10 g）；黃芪甲苷對照品（批號為 110781-01616，純度為 97.4%），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201212，純度為86.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈和磷酸二氫鈉為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

黃芪[5]302：取樣品 20 g，加甲醇60 mL，加熱回流 1 h，濾過，濾液加于中性氧化鋁柱（100～200目，5 g，內徑為10～15 mm）上，用40%甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次50 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成質量濃度為1 g／L的對照品溶液。按樣品處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。按 2015年版《中國藥典（四部）》通則 0502“薄層色譜法”試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V／V／V）下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

黃柏[5]305：取樣品 10 g，加甲醇 30 mL，超聲（功率為250 W，頻率為 40 kHz）處理 15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。取黃柏對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成質量濃度為0.5 g／L的對照品溶液。按腸可寧微丸處方和工藝制備缺黃柏、黃連藥材的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502“薄層色譜法”試驗，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯 -異丙醇 -甲醇 -濃氨液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5，V／V／V／V／V）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

2.2 鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS 柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（25 ∶75，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：345 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加流動相制得質量濃度為 40 μg ／mL 的對照品溶液。取樣品 0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸 -甲醇（1∶100，V／V）混合溶液100 mL，密塞，稱定質量，置50℃水浴中加熱15 min，取出，放冷，超聲處理30 min，放冷至室溫，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，10 000 r／min離心5 min，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按樣品處方和工藝制備缺黃連、黃柏的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗和專屬性考察：取上述3種溶液各適量，按擬訂色譜條件進行測定，記錄色譜圖，詳見圖2。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計應不低于4 000，分離度＞1.5，基線分離良好，陰性對照在與鹽酸小檗堿對照品相同保留時間處無干擾峰，表明系統(tǒng)適用性和專屬性良好。

線性關系考察：取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加流動相制得質量濃度為 10，20，50，80，100 μg ／mL的系列對照品溶液。精密量取上述溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標、鹽酸小檗堿質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝44193X-36 309，r＝0.999 7（n＝5）。結果表明，鹽酸小檗堿質量濃度在10～100 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次測定，記錄峰面積。結果的 RSD為1.27%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品（批號為2180311）溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8 h，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的 RSD為 2.31%（n＝5），表明供試品溶液在室溫放置8 h內基本穩(wěn)定。

重復性試驗：稱取同批（批號為20180311）樣品適量，精密稱定5份，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果的 RSD為1.53%（n＝5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為20180311，鹽酸小檗堿含量為7.315 2 mg／g），精密稱定6份，分別加入一定質量濃度的對照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件平行進樣測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果3批樣品中鹽酸小檗堿的含量分別為7.315 2，7.626 5，7.135 4 mg ／g。

3 討論

腸可寧微丸是我院應用多年的臨床制劑，其原方為散劑，但由于味苦、服用不方便，患者用藥依從性差，故將其劑型改良為微丸，并對其質量標準進行了研究。

鑒別黃柏時，嘗試了藥典方法及多種展開劑[6-7]，分離效果均不理想，最后選用甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇 -濃氨液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5，V／V／V／V／V）為展開劑，展開效果最好，能滿足黃柏的TLC鑒別要求。

鹽酸小檗堿是黃柏和黃連的主要成分，因此選取該成分為含量指標，考察了不同的流動相[8-10]，結果以乙腈 -0.05 mol／L 磷酸二氫鈉溶液（25∶75，V／V）為流動相時，分離度最好，樣品無干擾，適合鹽酸小檗堿的含量測定。

本研究中建立的方法操作簡單，精密度、穩(wěn)定性、重復性均好，專屬性強，可用于腸可寧微丸的質量控制。