高永民，秦啟亮，胡耀嘉

（1.青海省西寧市第一人民醫(yī)院藥品調(diào)配站，青海 西寧 810000； 2.青海省黃南藏族自治州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，青海 黃南 811399； 3.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

十味木香散為藏族經(jīng)驗(yàn)方，收載于六省區(qū)《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》，由木香、余甘子、蓽茇、豆蔻、馬尿泡、塞北紫堇、酸藤果、石榴子、人工牛黃、訶子10味藥材組方[1]，有驅(qū)蟲(chóng)、止痛功效，是藏醫(yī)用于治療“年”及蟲(chóng)引起的急性腹痛常用藥，使用歷史悠久，療效確切。目前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀和制劑通則中規(guī)定的檢查項(xiàng)，無(wú)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)。為了更全面控制其的內(nèi)在質(zhì)量，故本試驗(yàn)中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)木香、馬尿泡和人工牛黃等藥味進(jìn)行鑒別，同時(shí)采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定該制劑中木香的有效成分木香烴內(nèi)酯及去氫木香內(nèi)酯含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Inertsil C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；BSA323S型電子天平（德國(guó)賽多利斯儀器有限公司）；KQ-600型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TGL16MB型高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；ZF-6型三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

木香對(duì)照藥材（批號(hào)為 120921-201309）、去氫木香內(nèi)酯（批號(hào)為111525-201209）、硫酸阿托品（批號(hào)為100040-201011）、氫溴酸東莨菪堿（批號(hào)為 100049-200308）、膽酸（批號(hào)為 110775-201105）、豬去氧膽酸（批號(hào)為110749-201316），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；收集的5批次十味木香散樣品均為黃南藏族自治州藏醫(yī)院制劑室提供（批號(hào)分別為20140301，20140501，20140901，20150301，20150401）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

木香[2-3]：取樣品粉末 2 g，加乙醚 30 mL，超聲(功率200 W，頻率 40 kHz，下同)處理15 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取木香對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；按處方比例去除木香藥材，并按供試品溶液方法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法（2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則 0502，以下簡(jiǎn)稱“通則 0502”）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮（10∶3，V／V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液及對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1。

馬尿泡[4]：取樣品粉末10 g，加氨水5 mL潤(rùn)濕，用氯仿50 mL超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；取硫酸阿托品對(duì)照品、氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品，分別加甲醇，制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；按處方比例去除馬尿泡，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法(通則0502)試驗(yàn)，吸取4種溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨水（15∶6∶1，V／V／V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖 2。

圖1 木香薄層色譜圖

圖2 馬尿泡薄層色譜圖

圖3 人工牛黃薄層色譜圖

人工牛黃[5-6]：取樣品粉末1 g，加乙醇10 mL，振搖15 min，離心，取上清液，作為供試品溶液；另取膽酸、豬去氧膽酸對(duì)照品，加乙醇，制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液；按處方比例去除人工牛黃，并按供試品溶液方法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇（16 ∶4∶0.5∶1，V／V／V／V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖3。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[7-9]

色譜柱：Inertsil C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -水（58 ∶42，V／V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)按木香烴內(nèi)酯峰、去氫木香烴內(nèi)酯峰計(jì)均應(yīng)不低于3 000，分離度大于1.5，拖尾因子大于0.99。對(duì)照品溶液出峰位置上無(wú)干擾峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖4。

2.2.2 溶液制備

稱取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品8.14 mg、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品 10.87 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為 0.325 6 g／L 和 0.434 8 mg／mL 的混合對(duì)照品貯備液；精密量取上述混合對(duì)照品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為 0.065 1 g／L和0.087 0 g／L的混合對(duì)照品溶液。取樣品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照處方組成及比例，取除木香外的其余藥味，按制備工藝要求制成不含木香的制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 1，2，4，8，16，20 μL，按 2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，木香烴內(nèi)酯為 Y1＝1 266.22 X1-3.829，r＝0.999 6（n＝6）；去氫木香烴內(nèi)酯為 Y2＝1 321.22 X2-6.711，r＝ 0.999 4（n ＝6）。結(jié)果表明，木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯進(jìn)樣量分別在0.065 1～1.030 2 μg和 0.087 0 ～ 1.740 0 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述混合對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的 RSD分別為0.86%和 0.83%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖4 十味木香散高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取批號(hào)為20140501的樣品，制備供試品溶液，分別于 0，2，4，8，10，12 h 時(shí)進(jìn)樣 5 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的 RSD分別為 1.04%和 0.99%（n＝6），表明供試品溶液在 12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20140501）樣品1 g，依法制備供試品溶液 6份，分別進(jìn)樣 5 μL，按 2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的 RSD 分別為 0.91% 和 0.73% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20140501，木香烴內(nèi)酯含量為 2.093 mg／g，去氫木香內(nèi)酯含量為 2.568 mg ／g）6 份，每份 0.5 g，精密稱定，分別精密加入木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為0.325 6 mg／mL 和 0.434 8 mg／mL 的混合對(duì)照品溶液各3 mL，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取5批十味木香散，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣記錄峰面積值，并計(jì)算木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量。以5批樣品平均含量下浮20%作為本品的含量限度標(biāo)準(zhǔn)，故暫定本品每克含木香以木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯的總量計(jì)不得少于3.59 mg／g。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)不同極性提取溶劑、提取方法及提取時(shí)間進(jìn)行考察，建立了方中木香、馬尿泡、人工牛黃的TLC鑒別方法；曾對(duì)方中的其他藥味開(kāi)展研究，但由于其陰性對(duì)照干擾較大或?qū)φ账幉?、?duì)照品不易得到等原因，試驗(yàn)未成功。木香中木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯的含量測(cè)定試驗(yàn)過(guò)程中，分別考察了以乙酸乙酯、氯仿、甲醇為提取溶劑的情況，結(jié)果顯示，以甲醇為溶劑時(shí)的提取率高于乙酸乙酯、氯仿，因此選用甲醇為供試品提取溶劑；還考察以乙腈-水、甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)的分離情況，結(jié)果用甲醇-水溶液為流動(dòng)相時(shí)基線較平穩(wěn)，對(duì)被測(cè)組分峰無(wú)干擾，因此選擇甲醇-水作為流動(dòng)相。

方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，本研究中建立了鑒別木香、馬尿泡、人工牛黃的TLC法，分離效果好，陰性無(wú)干擾，同時(shí)建立了測(cè)定木香中木香烴內(nèi)酯及去氫木香內(nèi)酯含量的HPLC法，方法可行，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性良好，分離度好，陰性無(wú)干擾，故本研究中建立的方法可用于十味木香散的質(zhì)量控制。