●晁利芹 潘曉麗 王 付

赤丸是《傷寒雜病論》中辨治寒痰的重要用方之一，辨治“寒氣，厥逆”。導(dǎo)師王付教授根據(jù)張仲景用方要點(diǎn)并結(jié)合自身臨床經(jīng)驗(yàn)常用于辨治閉塞性脈管炎、深部靜脈炎以及慢性胃炎等。其方由烏頭、半夏、茯苓、細(xì)辛所組成，其中“烏頭與半夏”為用藥禁忌中“十八反”內(nèi)容之一。為此筆者查閱了相關(guān)赤丸的實(shí)驗(yàn)研究和臨床運(yùn)用情況，發(fā)現(xiàn)其研究?jī)H僅局限于相反藥對(duì)及單味藥[1]，故本課題重點(diǎn)開(kāi)展赤丸方藥配伍的整體性及其相互關(guān)聯(lián)性的慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究，觀察其水煎液對(duì)大鼠心臟的毒理作用，以期為臨床安全用藥提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，共80只，體質(zhì)量200±10g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（豫）2005-0001。動(dòng)物房?jī)?nèi)的飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22℃±3℃，濕度60%±10%，聲響＜60分貝，無(wú)對(duì)流風(fēng)，人工晝夜（12h／12h）。大鼠飼料由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究涉及所有實(shí)驗(yàn)均通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)。

1.2 試劑與儀器75%乙醇：100mL，洛陽(yáng)德之康生物工程有限公司，批號(hào)：090706；95%乙醇：2500mL，衛(wèi)輝市眾誠(chéng)消毒制劑有限公司，批號(hào)：090206；烏拉坦：上海曹揚(yáng)第二中學(xué)化工廠生產(chǎn)，批號(hào)：080517；肝素鈉注射液：2mL，12500U，江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：09 061012；甲醛溶液：天津市博迪化工有限公司，500mL/瓶，批號(hào)：20 080823；BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)心電圖：成都泰盟公司；全自動(dòng)生化分析儀：型號(hào)AT-738，上海安泰分析儀器有限公司；生物顯微鏡：型號(hào)OLYMPUS-CX40，日本奧林巴斯公司；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：型號(hào)LEICA2025，德國(guó)徠卡儀器有限公司；電子天平：型號(hào)AE-240METTLER；賽多利斯精密天平：型號(hào)BS210S，北京賽多利斯天平有限公司；電熱恒溫干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；LEICARM2135型石蠟切片機(jī)：德國(guó)LEICA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及制備實(shí)驗(yàn)藥物：于鄭州市華龍中藥行購(gòu)買(mǎi)茯苓、生川烏、遼細(xì)辛、法半夏四味中藥材，并由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定合格。

藥物制備：依據(jù)全國(guó)高等中醫(yī)藥院?！督饏T要略》赤丸方的用量按重浸漬法[2]提取藥物成份，并濃縮為濃度200%（2g生藥/mL）的溶液。制備方法如下：取茯苓12g、生川烏6g、法半夏12g、遼細(xì)辛3g，依比例計(jì)算、稱量、粉碎所需受試藥物，將上藥混合用實(shí)驗(yàn)所需的水溶液分三次提取有效成分，將三次浸提液混合過(guò)濾，調(diào)整至實(shí)驗(yàn)所需容積，加熱沸騰后持續(xù)煎煮60min，濾其藥液；所得藥液的量即為當(dāng)天各給藥組所需濃度為200%（2g生藥/mL）的溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：80只Wistar大鼠，雌雄各半分籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)每20只雌雄各半大鼠分為1組，共分4組，即赤丸水煎液高劑量組、中劑量組、低劑量組、正常對(duì)照組。

（2）實(shí)驗(yàn)分期：實(shí)驗(yàn)全程分為灌胃期和恢復(fù)期兩期。灌胃期是大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，持續(xù)灌胃90天的這個(gè)時(shí)期?；謴?fù)期是灌胃結(jié)束后，每組隨機(jī)選10只大鼠處死檢測(cè)，剩余的40只大鼠停止灌胃，繼續(xù)一般飼養(yǎng)3周的這段時(shí)間。

（3）給藥方法：各給藥組根據(jù)人與大鼠的體表面積比，即大鼠用藥為人用藥量的7倍，依次按33g、16.5g、5.5g生藥/（kg·d）劑量灌胃，對(duì)照組用蒸餾水灌胃，灌胃體積為同等體重條件下高劑量組大鼠灌胃時(shí)所需藥液的劑量。每日定時(shí)（15：00）灌胃1次，6次/周灌胃，每周日檢測(cè)大鼠的體重，每周根據(jù)稱重情況調(diào)整給藥劑量，各組連續(xù)灌胃90天。

（4）實(shí)驗(yàn)樣品收集：末次灌胃后，大鼠禁食不禁水2h，腹主動(dòng)脈取血于普通的真空采血管中，4℃，3000r/min，離心15min，收集上清液，于-80℃保存?zhèn)溆谩２裳戤吅?，剖腹迅速取出完整心臟，除凈周?chē)慕Y(jié)締組織，切取大鼠同一部位的心臟組織，放入裝有4%甲醛溶液的標(biāo)本瓶里，固定48h后，脫水，置于包埋盒中，做好標(biāo)記，切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察心臟組織病理學(xué)變化。

（5）一般中醫(yī)癥候指標(biāo)觀察：神志、皮毛、呼吸、行動(dòng)、飲食、二便、分泌物等表現(xiàn)。

（6）心電圖檢測(cè)：灌胃前，每組隨機(jī)選10只大鼠在乙醚麻醉作用下采用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行心電圖檢測(cè)，并于末次給藥后的次日的上午，進(jìn)行相同的心電圖檢查。

（7）心功能指標(biāo)測(cè)定：LDH、CK。在灌胃期結(jié)束末次大鼠心電圖檢測(cè)后，腹腔注射20%的烏拉坦（5mL/kg）進(jìn)行麻醉，然后，從大鼠的腹主動(dòng)脈取5mL血液，離心，存放，檢測(cè)。

（8）恢復(fù)期大鼠的檢測(cè)方法：進(jìn)行與給藥期相同的檢測(cè)，借此觀察赤丸方的毒性反應(yīng)是否具有可逆性，抑或是否出現(xiàn)遲緩性的毒性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，各組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤丸水煎液對(duì)大鼠一般生長(zhǎng)情況的影響在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除赤丸水煎液高劑量組大鼠外，其余各組大鼠在飼養(yǎng)期間，狀態(tài)良好，精神佳，活動(dòng)靈活，皮毛光滑有色澤，食欲正常，未見(jiàn)異常分泌物。赤丸水煎液高劑量組大鼠飼養(yǎng)期間，精神不振，行動(dòng)遲緩，皮毛不光滑，腹部微脹，食欲差并伴有不同程度的腹瀉。其中有2只大鼠在灌胃的第4、5周出現(xiàn)異常反應(yīng)，體重增長(zhǎng)較正常大鼠的速度慢，于第11、12周時(shí)，有5只大鼠出現(xiàn)了中毒反應(yīng)，第67、83天，有2只大鼠死亡，隨即解剖2只大鼠制作心臟病理切片，觀察心臟組織形態(tài)。余實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常情況。

2.2 赤丸水煎液對(duì)大鼠體重的影響灌胃前：不同大鼠實(shí)驗(yàn)組間體重?zé)o顯著差異（P＞0.05）；灌胃期：與正常對(duì)照組比較，赤丸水煎液低、中劑量組大鼠體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05），赤丸水煎液高劑量組大鼠的體重明顯增長(zhǎng)緩慢（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在動(dòng)物試驗(yàn)中，體重?cái)?shù)值的高低可以作為整個(gè)機(jī)體變化的一個(gè)重要指標(biāo)，在本課題的赤丸水煎液慢性毒理試驗(yàn)過(guò)程中，每周稱量大鼠體重，既是調(diào)整給藥劑量的依據(jù)，又是觀察大鼠毒性反應(yīng)的一個(gè)重要試驗(yàn)指標(biāo)。本課題結(jié)果證實(shí)，赤丸水煎液高劑量組大鼠的體重受到了很大的影響，余給藥組大鼠的體重未受到影響?；謴?fù)期：不同給藥組大鼠的體重與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。提示：長(zhǎng)期大劑量口服赤丸水煎液對(duì)大鼠體重的增長(zhǎng)具有影響作用，然而，一旦停止給藥一段時(shí)間后，就可恢復(fù)到正常體重。見(jiàn)表1。

2.3 赤丸水煎液對(duì)大鼠心電圖的影響灌胃前：與對(duì)照組比較，不同赤丸水煎液劑量組大鼠的心電圖包括心率，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。灌胃期：與對(duì)照組比較，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心電圖、心率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）?；謴?fù)期：不同給藥組大鼠的心電圖、心率與正常對(duì)照組相比也無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。本結(jié)果心率平均在335次/min。II、Ⅲ、avF導(dǎo)聯(lián)p波直立高尖，avR導(dǎo)聯(lián)倒置，時(shí)限、振幅正常，QRS波V1導(dǎo)聯(lián)主波向下，Ⅱ、Ⅲ、aVF向上，時(shí)限及振幅未見(jiàn)異常，J點(diǎn)抬高，T波前支陡后支緩?？梢钥闯?，長(zhǎng)期灌服低、中、高劑量的赤丸水煎液對(duì)大鼠心臟無(wú)毒性反應(yīng)。心電圖見(jiàn)圖1，心率結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠體重比較（g，）

表1 各組大鼠體重比較（g，）

注：與對(duì)照組比較，★P＜0.05

圖1 赤丸方水煎液對(duì)大鼠心電圖的影響

2.4 赤丸水煎液對(duì)大鼠心肌酶的影響灌胃期：赤丸水煎液不同劑量組大鼠的LDH、CK與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。本結(jié)果證實(shí)，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心肌細(xì)胞均未受到損害?；謴?fù)期：不同赤丸水煎液實(shí)驗(yàn)組大鼠的LDH、CK與正常對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。本課題結(jié)果說(shuō)明，不論灌胃期，還是恢復(fù)期，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心肌細(xì)胞均未受到損害。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠心率比較（次，）

表2 各組大鼠心率比較（次，）

2.5 赤丸水煎液對(duì)大鼠心臟的組織形態(tài)的影響整體情況：不同實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟的結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，形態(tài)體積、色澤均正常，未見(jiàn)水腫、充血、糜爛，組織無(wú)隆起、脫落，觸及質(zhì)地也未發(fā)現(xiàn)異常。

形態(tài)組織學(xué)觀察：在灌胃期、恢復(fù)期，在光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)各組大鼠的心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)結(jié)果具有一致性，均可見(jiàn)到由心外膜、心肌膜、心內(nèi)膜構(gòu)成的心臟壁，心肌細(xì)胞排列整齊，核居中，無(wú)變性、壞死等損傷性改變，間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、缺血、水腫等病理性改變。

表3 各組大鼠LDH、CK變化比較（U/L，）

表3 各組大鼠LDH、CK變化比較（U/L，）

本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在灌胃期及恢復(fù)期，各組大鼠的心臟組織形態(tài)皆未出現(xiàn)異常。見(jiàn)圖2。

圖2 光鏡下赤丸水煎液對(duì)大鼠心臟形態(tài)學(xué)的影響

3 討論

王付教授在臨床中經(jīng)常辨證使用赤丸方加味治療各種疑難雜癥[3]，療效卓著。由于赤丸組方之藥性的特殊性，所以進(jìn)行該方的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究是很有必要的?；诒緦?shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)赤丸水煎方對(duì)機(jī)體肝、腎、內(nèi)分泌系統(tǒng)均無(wú)毒性反應(yīng)[4]，本研究則進(jìn)一步探討赤丸水煎液有無(wú)心臟毒性的影響，借此觀察存否心臟的急毒與慢毒反應(yīng)，是否具有可逆性。在給藥期，高劑量組大鼠體重增長(zhǎng)顯著緩慢，但停藥21d后，大鼠體重恢復(fù)到正常水平。不論在給藥期還是恢復(fù)期，各組大鼠的心率、心電圖、心肌酶（LDH、CK）及心臟組織病理學(xué)均未現(xiàn)病理性改變。

赤丸方中雖然含有有毒中藥，且有十八反的配伍禁忌藥物，但是在研究中發(fā)現(xiàn)低、中、高濃度的赤丸水煎液對(duì)大鼠心臟均未產(chǎn)生不良的反應(yīng)。赤丸方中，茯苓性味甘、淡、平，無(wú)毒副作用，且有免疫調(diào)節(jié)和保肝護(hù)肝的作用。細(xì)辛，辛、溫，有小毒?！吨袊?guó)藥典》將細(xì)辛的成人日用量定為不得超過(guò)3g[5]。在赤丸方中細(xì)辛用量為一兩（3g），屬安全范圍。烏頭辛、甘、大熱，有大毒，其毒性可隨煎煮時(shí)間延長(zhǎng)而減弱或消失[6]。半夏辛、溫，有小毒。半夏與烏頭屬于十八反，屬配伍禁忌。但從藥理毒理相互作用上看，其毒性很可能被消除或減弱。烏頭的毒性主要為心臟的毒性及神經(jīng)系統(tǒng)毒性。而現(xiàn)代藥理研究表明半夏具有鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)吐、抗心律失常的作用，能夠很好的拮抗烏頭引起的心臟毒性[7-9]。同時(shí)，細(xì)辛還具有強(qiáng)心、擴(kuò)血管、降壓及保護(hù)心肌的作用。全方半夏燥濕化飲，茯苓利濕化飲，烏頭、細(xì)辛既能通陽(yáng)散寒又能溫化寒飲，四藥相互為用，以建其功[10]。

綜上所述，赤丸方水煎液對(duì)心臟未見(jiàn)毒性反應(yīng)，為臨床治療寒飲內(nèi)阻之痼疾提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。