陳 興，張 璐，吳詩華，王 濤，高思佳，王 丹，趙艷玲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100039； 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310053)

目前，心血管疾病已成為全球第1位致死、致殘的疾病原因，危害甚至超過惡性腫瘤；其中，缺血性心臟病是臨床上心血管疾病中較為常見的病理現(xiàn)象，其發(fā)病率更呈逐年升高趨勢[1-2]。因此，保護(hù)缺血心肌一直是心血管領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，國內(nèi)外眾多專家學(xué)者都在致力于探索預(yù)防和治療此類心血管疾病的有效手段。人參為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，人參“主補(bǔ)五臟，安精神，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智”[3]。人參作為最著名的中草藥之一，貴為中草藥中的“百草之王”，在我國已被廣泛應(yīng)用了幾千年，是我國重要的中藥寶藏。關(guān)于人參的研究和應(yīng)用一直受到國內(nèi)外的普遍重視，隨著科技不斷進(jìn)步和發(fā)展，對人參化學(xué)成分及藥理作用的研究已取得了重大進(jìn)展?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，人參在心血管疾病方面具有明確的療效，能夠改善心肌缺血、調(diào)控心律失常、抑制血管細(xì)胞凋亡和舒張血管等[4-9]。然而，大多數(shù)關(guān)于人參改善心肌缺血的作用機(jī)制研究都是基于離體細(xì)胞或動(dòng)物模型，其對人體的作用機(jī)制尚不明確[10-13]。因此，探索人參改善人體心肌缺血的作用機(jī)制具有重要的意義。

中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)導(dǎo)致中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清晰，作用基礎(chǔ)不明確，甚至很難從整體到組織、器官、細(xì)胞和分子水平進(jìn)行全面系統(tǒng)的中藥研究，使得中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展一再遇到困阻。因此，闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制是排除中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展障礙亟待解決的重大問題[14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在此契機(jī)下應(yīng)運(yùn)而生，其概念由英國藥理學(xué)家Hopkins率先提出，是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科技術(shù)和內(nèi)容的研究手段，運(yùn)用各種組學(xué)、高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)可視化和網(wǎng)絡(luò)分析等多種技術(shù)，建立“藥物成分-基因-靶點(diǎn)-通路-疾病”之間的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從多維度視角考察中藥對多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，系統(tǒng)揭示中藥核心分子靶點(diǎn)和藥效學(xué)生物網(wǎng)絡(luò)，并理解疾病的分子基礎(chǔ)，預(yù)測藥物的藥理學(xué)作用機(jī)制，評估藥物的有效性、作用途徑及不良反應(yīng)，從而發(fā)現(xiàn)高效低毒的藥物，提高臨床藥物的治療效果[15]。因此，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究方法，旨在對人參改善心肌缺血的作用機(jī)制進(jìn)行探討，以期為人參治療心血管疾病的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的建立

首先在中草藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine database @Taiwan，TDT)(http：//tcm.cmu.edu.tw/)中獲得人參所含有的活性成分結(jié)構(gòu)，再經(jīng)中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http：//lifecenter.sgst.cn/hit/)及治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)篩選人參活性成分的作用靶點(diǎn)，建立人參性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)篩選出心肌缺血相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)，建立心肌缺血靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過交互蛋白數(shù)據(jù)庫(database of interacting protein，DIP)(http：//dip.doe-mbi.ucla.edu)獲得靶點(diǎn)連接蛋白。以上所有靶點(diǎn)均轉(zhuǎn)化成UniProt數(shù)據(jù)庫識(shí)別碼格式，以便于統(tǒng)一的研究分析。

1.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為更合理地闡明人參中活性成分與心肌缺血靶點(diǎn)之間的關(guān)系，對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(http：//www.genome.jp/kegg/)分析，將人參的化學(xué)成分、成分對應(yīng)的靶點(diǎn)、心肌缺血對應(yīng)的靶點(diǎn)和交互蛋白對應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行整合，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 2.8.3軟件將以上網(wǎng)絡(luò)分析圖進(jìn)行可視化，并通過CentiScape 1.2軟件對每節(jié)點(diǎn)的中介中心性、點(diǎn)度中心性和接近中心性等3個(gè)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析評估，選擇點(diǎn)度中心性2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)，作為人參改善心肌缺血的目標(biāo)蛋白靶點(diǎn)。

1.3 基因本體(gene ontology，GO)富集分析

為了說明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，利用Cytoscape 2.8.3軟件對蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，分別從功能、參與的生物途徑及細(xì)胞中的定位對基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化描述，并繪制GO分析條目圖。

1.4 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

為了說明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用，利用ArrayTrack v.3.5.0軟件，將“1.2”項(xiàng)下所得直接作用靶點(diǎn)的UniProt數(shù)據(jù)庫識(shí)別碼導(dǎo)入其中，進(jìn)行KEGG通路富集分析，得出交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點(diǎn)分布的相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 “成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

基于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建方法，共篩選出人參活性成分59個(gè)、交互蛋白40個(gè)及藥物與疾病共同直接作用的蛋白靶點(diǎn)15個(gè)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建出人參改善心肌缺血作用的交互網(wǎng)絡(luò)圖，采用不同形狀圖形使其可視化后，可清晰直觀地看出藥物化學(xué)成分與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見圖1。其中，三角形為藥物化學(xué)活性成分，圓形為交互作用蛋白，正方形為藥物化學(xué)成分和疾病共同直接作用的蛋白靶標(biāo)。為了更具特異性地反應(yīng)出“成分-蛋白-疾病”的之間關(guān)系，再以圖1中的共同直接作用蛋白靶點(diǎn)為中心，進(jìn)一步構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)交互圖，見圖2。

2.2 人參活性成分及心肌缺血共同直接作用靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)

“成分-靶點(diǎn)-疾病“交互網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，藥物與疾病共同直接作用的蛋白靶點(diǎn)有15個(gè)，其可能是人參改善心肌缺血作用的最相關(guān)蛋白靶點(diǎn)，因此，對該15個(gè)蛋白靶標(biāo)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。

圖1 人參改善心肌缺血作用的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Interactive network of “compound-target-disease” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

圖2 人參改善心肌缺血作用的“成分-直接作用靶點(diǎn)”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Interactive network of “compound-direct targets” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

表1 人參改善心肌缺血作用的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析Tab 1 Topological parameter analysis of direct targets of interactive network of “compound-target-disease” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

2.3 GO分析

對相關(guān)蛋白靶點(diǎn)在基因功能中的作用進(jìn)行研究，共得到GO分析條目24個(gè)，見圖3。根據(jù)人參改善心肌缺血作用預(yù)測靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果，可知相關(guān)蛋白涉及的基因功能包括“negative regulation of caleium iontransport”(鈣離子運(yùn)輸?shù)呢?fù)調(diào)節(jié))、“negative regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway”(外源性凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控)、“active regulation of active oxygen metabolism”(活性氧代謝調(diào)節(jié))和“nitric oxide biosynthetic process”(一氧化氮生物合成過程)等方面。

2.4 KEGG通路分析

對網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析結(jié)果顯示，所有相關(guān)蛋白靶標(biāo)的3個(gè)拓?fù)鋮?shù)點(diǎn)度中心性、中介中心性和接近中心性的中位數(shù)分別為1、0和0.248 394 73。KEGG通路富集分析共富集出43條通路與人參改善心肌缺血的功效相關(guān)，主要包括甲狀腺激素信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、FcεRI信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路和腫瘤壞死因子信號(hào)通路等，見表2。

3 討論

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，進(jìn)而導(dǎo)致心臟的供氧不足，心肌能量代謝不正常，難以支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。導(dǎo)致心肌缺血因素有很多，除個(gè)人飲食、生活習(xí)慣、心理、社會(huì)和環(huán)境等多種外界因素外，冠狀動(dòng)脈阻塞，血壓降低、主動(dòng)脈供血減少，血液黏稠度變化和心肌本身病變等內(nèi)在因素為導(dǎo)致心肌缺血的直接因素；其中，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈狹窄或閉塞又為引起心肌缺血最主要、最常見的病因[16-18]。近年來，眾多學(xué)者對人參在心血管疾病方面的作用進(jìn)行了大量而深入的研究，發(fā)現(xiàn)人參在改善心肌缺血時(shí)，可以顯著提高氧自由基水平[8]；明顯增加冠狀動(dòng)脈血流量和心輸出量，增加左心室內(nèi)壓最大上升速率，降低左心室舒張末壓、冠狀動(dòng)脈阻力和總外周阻力[9]；改善血流動(dòng)力學(xué)、調(diào)節(jié)血管功能，刺激血管再生，抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡[11，19]；還能保護(hù)心血管系統(tǒng)，封閉鈣離子運(yùn)動(dòng)通道，并刺激人體內(nèi)皮細(xì)胞，使其釋放更多的一氧化氮，進(jìn)一步促進(jìn)血管舒張[4，20-21]。

圖3 人參改善心肌缺血作用的GO分析Fig 3 GO analysis of ginseng in treatment of myocardial ischemia

序號(hào)通路計(jì)數(shù)百分比/%P1甲狀腺激素信號(hào)通路1025.03.20×10-92鞘脂信號(hào)通路922.51.00×10-73雌激素信號(hào)通路820.04.80×10-74局部粘著1025.05.60×10-75催乳素信號(hào)通路717.51.20×10-66神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路820.01.80×10-67磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路1127.55.10×10-68細(xì)胞凋亡615.01.30×10-59wnt信號(hào)通路717.55.70×10-510ErbB信號(hào)通路615.06.80×10-511血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路512.52.30×10-412p53信號(hào)通路512.53.40×10-413細(xì)胞周期615.03.60×10-414轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路615.05.20×10-415促性腺激素信號(hào)通路512.51.10×10-316催產(chǎn)素信號(hào)通路615.01.10×10-317絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路717.51.60×10-318T細(xì)胞受體信號(hào)通路512.51.70×10-319胰島素抵抗512.52.00×10-320FcεRI信號(hào)通路410.04.80×10-321泛素介導(dǎo)的蛋白水解512.54.80×10-322B細(xì)胞受體信號(hào)通路410.05.00×10-323Jak-STAT信號(hào)傳送途徑512.55.90×10-324孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟410.09.40×10-325蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工512.51.00×10-226低氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路410.01.30×10-227趨化因子信號(hào)通路512.51.40×10-228Toll樣受體信號(hào)通路410.01.60×10-229腫瘤壞死因子信號(hào)通路410.01.60×10-230環(huán)磷酸腺苷信號(hào)傳導(dǎo)途徑512.51.70×10-231多巴胺能突觸410.02.60×10-232血小板活化410.02.70×10-233破骨細(xì)胞分化410.02.80×10-234核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體信號(hào)通路37.53.10×10-235胰島素信號(hào)通路410.03.20×10-236胞吞作用512.54.00×10-237長時(shí)程增強(qiáng)作用37.54.40×10-238脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路37.54.90×10-239環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G信號(hào)通路410.05.10×10-240瞬時(shí)受體電位通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)37.58.80×10-241Rap1信號(hào)通路410.08.90×10-242胰高糖素信號(hào)通路37.58.90×10-243黑素原生成37.59.10×10-2

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出人參中59個(gè)活性、成分40個(gè)交互蛋白及15個(gè)藥物與疾病共同直接作用的蛋白靶點(diǎn)，構(gòu)建了“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖，并對靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋分析，明確了相關(guān)蛋白靶點(diǎn)的功能類別及參與改善心肌缺血作用的信號(hào)通路。GO功能富集分析結(jié)果證實(shí)，人參改善心血管疾病的基因功能主要體現(xiàn)在鈣離子運(yùn)輸?shù)呢?fù)調(diào)節(jié)、外源性凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控、活性氧代謝調(diào)節(jié)和一氧化氮生物合成等過程。在基因的KEGG通路富集中，共篩選得到43條信號(hào)通路，其中，與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路有甲狀腺激素信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶通路，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路，孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟，促性腺激素信號(hào)通路等；與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路有FcεRI信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等；與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的信號(hào)通路有血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路等；與抑癌相關(guān)的信號(hào)通路有p53信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。因此，推測人參中的活性成分可能通過作用于上述信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子達(dá)到改善心肌缺血的目的。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中醫(yī)藥研究的一種新方法，研究思路遵循中醫(yī)藥的整體觀，從整體的角度去探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，明確中藥是一種多成分的協(xié)同作用體系，通過作用于不同的蛋白靶標(biāo)，調(diào)控機(jī)體的多種生物功能及信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮整體的治療機(jī)制。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討了人參改善心肌缺血的作用機(jī)制，明確了中藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路和整合調(diào)節(jié)作用等特點(diǎn)，同時(shí)揭示了人參改善心肌缺血的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為人參用于改善心肌缺血的藥物研究提供了依據(jù)，為中醫(yī)藥的研究和發(fā)展提供了新的思路和方法。