王 越， 李秋芬， 張 艷

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院， 上海 201306；2.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071)

細菌的氮代謝是海洋生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的主要驅動者之一[1]，也是建立生物脫氮技術的主要依據(jù)[2]，其中硝酸鹽還原是氮代謝中最重要的步驟之一[3]。細菌的硝酸鹽還原分為異化型和同化型，大多數(shù)脫氮細菌同時具有同化硝酸鹽還原途徑和異化硝酸鹽還原途徑[4]，如海桿菌(Marinobactersp. )NY-4[5]。異化型的硝酸鹽還原又包括硝酸鹽異化還原成銨和微生物在厭氧條件下將硝酸鹽還原為N2、N2O或NO的反硝化作用，這2種途徑的第一步都是在異化型硝酸鹽還原酶(Dissimilatory nitrate reductase，Nar)的作用下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，進而進行后續(xù)步驟，可見異化型硝酸鹽還原酶是生物脫氮過程中的關鍵酶[6-7]。據(jù)報道大腸桿菌(Escherichiacoli)和雞腸血清沙門氏桿菌(Salmonellaentericaserovar gallinarum)中將硝酸鹽轉化成亞硝酸鹽的酶是由基因簇narGHJI編碼的[8-10]，它們分別編碼組成膜內(nèi)Nar的α、β、γ、和δ四個亞基，其中narG編碼膜內(nèi)Nar的最大結構基因,通常有3 600 bp[11-12]，其活性位點位于向著細胞質一面的細胞膜表面[13]。Pérezrodríguez 等[14]使用narG基因作為硝酸鹽還原菌的診斷標記，來研究深海熱液區(qū)的微生物群落。Oikawa等[15]通過構建narG的缺失變體確定深海脫氮菌假單胞菌(Pseudomonassp.) MT-1中該基因編碼異化硝酸鹽還原酶，但不同的菌中，構成該基因簇的基因也不盡相同，如：有的菌中narH代替了narY、narI代替了narV[16]。基因的不同也可能會影響該菌的異化硝酸鹽還原酶的結構和功能。

本實驗室篩選獲得一株海水細菌X3，具有脫氮功能[17]，后鑒定為嗜堿鹽單胞菌(Halomonasalkaliphila)，研究其脫氮特性和環(huán)境適應性，發(fā)現(xiàn)菌株X3可同時去除氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮[18]，但尚未對該菌株氮代謝路徑的相關功能基因做進一步研究，也未見有針對Halomonasalkaliphila功能基因的相關報道。本文在前期對該菌的全基因組測序(GenBank登錄號： cp024811)預測到其氮代謝通路中含有narGYJV基因簇的基礎上，報告了對該菌株氮代謝途徑中nar基因簇功能的驗證及編碼的Nar蛋白結構預測的結果，以期為下一步研究該菌的氮代謝機理和調(diào)控奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 實驗所用菌株為由本實驗室從海水中分離純化所得的嗜堿鹽單胞菌X3，采用甘油冷凍法保存于-80℃冰箱[19]。

培養(yǎng)基：硝酸鹽還原培養(yǎng)基，參照李洪鵬等的配方[17]，并有所改進。具體如下：NH4Cl 0.5g，MgSO40.1g，NaH2PO40.2g，K2HPO40.5g，CaCO31g，F(xiàn)eSO40.1g，KNO31g，F(xiàn)e3PO40.1g，葡萄糖1g，pH=7.8，滅菌海水1 000 mL。

1.1.2 主要藥品與試劑 主要化學試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純；所采用的試劑盒包括：GENMED Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒、GENMED 細菌異化型硝酸鹽還原酶活性比色法定量檢測試劑盒、TIANamp Bacteria DNA Kit 細菌基因組DNA提取試劑盒、天根RNAprep Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒、熒光定量的試劑盒Takara One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶活測定 首先在硝酸鹽還原培養(yǎng)基中，菌株X3擴大培養(yǎng)至OD600(Optical density在600 nm處的吸光值)為0.4～0.8 (即1×107～2×107細胞/mL)，然后用Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒測定樣品溶液中的蛋白質濃度，測定方法參照試劑盒的說明書，用96孔板微量測定。再運用細菌異化型硝酸鹽還原酶定量檢測試劑盒測定Nar的酶活，測定方法按照說明書中的酶標儀測定法，先按照操作步驟，利用試劑盒中的標準樣品，建立縱坐標為吸光值OD540、橫坐標為標準亞硝酸鹽濃度的標準曲線，對樣品進行測定后，根據(jù)標準曲線獲得樣品對應的亞硝酸鹽濃度，進行下列公式的計算獲得酶活。其中異化型硝酸鹽還原酶的活性單位定義為37 ℃、pH=7.5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1nmol硝酸鹽所需要的酶量為一個活性單位，計算公式如下：

1.2.2 反轉錄熒光定量PCR(qRT-PCR) 以硝酸鹽還原培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株X3，運用RNA提取試劑盒提取該菌株的總RNA，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸蛋白分析儀檢測RNA的質量。引物選用NarG1F、NarG1R (見表1)。實時熒光定量PCR的反應體系采用25 μL：2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5 μL，TaKaRa Ex TaqHS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4 μL，引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，Eva green 0.8 μL，模板1 μL(其中陽性對照為菌株X3的基因組 DNA，陰性對照為無菌水，實驗組為總RNA)，RNase Free dH2O 8.9 μL。反應時間為42 ℃，10 min；95 ℃，1 min；95 ℃，10 s；55 ℃，30 s。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 生物信息學分析 運用DNAMAN翻譯得到Nar四亞基的各氨基酸序列，通過ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi) 在線預測得到Nar開放閱讀框，然后運用在線軟件SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/ SignalP-3.0/) 對信號肽和分泌蛋白的有無進行預測；并運用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 預測氨基酸序列有無跨膜結構，用在線軟件ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/) 分析氨基酸序列組成以及等電點和分子量。運用在線軟件NPS Network ProteinSequenceAnalysis (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsaautomat.pl?page=/NPSA/ npsa_sopma.html) 進行蛋白質二級結構的分析[20]。最后運用Phyre2對四個基因編碼蛋白的三維結構進行預測，并在蛋白質庫PDB中檢索同源蛋白[21]；通過BLAST比對同源氨基酸序列，運用MAGE 5.0構建基于narG和narY編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果

2.1 酶活驗證結果

通過酶活性測試驗證了narGYJV基因簇存在的可能性及其功能。培養(yǎng)菌株X3至OD600=0.7時，測得蛋白質濃度為0.013 μg/μL，且在OD540處的吸光度為0.082，根據(jù)圖1標準曲線計算得樣品中亞硝酸鹽濃度為5.618 μmol/L，將數(shù)值代入1.2.1的酶活力公式進行計算，并根據(jù)對酶活單位的定義，得出菌株X3的異化硝酸鹽還原酶為每克蛋白21.415 U。

圖1 異化型硝酸鹽還原酶酶活標準曲線Fig.1 Standard curve of the enzyme activity of the dissimilatory nitrate reductase

2.2 轉錄水平上的驗證結果

對菌株X3的qRT-PCR驗證結果 (見圖2)顯示菌株X3的RNA可以擴增得到目的片段，且CT值約為27，證明了narGYJV基因簇在X3中存在并具有表達活性。圖3中的熔解曲線具有單一峰，證明所用引物具有特異性。

(a.陽性對照；b.樣品；c.陰性對照。a.Positive control; b. Sample; c.Negative control.)

圖2 qRT-PCR結果
Fig.2 qRT-PCR results

2.3 生物信息學分析

據(jù)全基因組測序獲得的菌株X3的異化型硝酸鹽還原酶基因簇中4個基因narG、narY、narJ和narV的序列(GenBank登錄號：MG776025～MG776028)，全序列翻譯得到2 280個氨基酸，在該氨基酸序列中檢測到4個蛋白功能域，1～1 246氨基酸屬于NarG超家族，編碼Nar的α亞基；1 261～1 752氨基酸屬于DMSOR-beta-like 超家族，編碼Nar的β亞基；2 061～2 279氨基酸 編碼γ亞基，1 802～2 018氨基酸編碼δ亞基(見圖4)。經(jīng)軟件TMHMM Server和ProtParam tool分析，此氨基酸序列沒有信號肽但有跨膜結構，等電點為5.86，分子量256 453.72 Da，帶負電荷的氨基酸(Asp + Glu) 289個，占總蛋白的12.7%，帶正電荷的氨基酸(Arg + Lys) 242個，占總蛋白的10.6%，蛋白序列中有36個半胱氨酸，不穩(wěn)定系數(shù)是40.20，是一種不穩(wěn)定蛋白，脂溶性為79.77，總平均親水性為-0.341。NPS Network Protein Sequence Analysis預測的二級結構顯示無規(guī)卷曲占37.59%，α螺旋占34.43%，延伸鏈占18.33% (見圖5)。

(a.陽性對照；b.樣品；c.陰性對照。 a.Positive control; b. Sample; c.Negative control.)

圖3 qRT-PCR熔解曲線
Fig.3 Melting curve of qRT-PCR

結合圖6和表2分析NarGYJV的蛋白3D結構預測，Phyre2預測的NarG、NarY和NarV蛋白3D結構(見圖6(a)、(b)、(c))，在PDB中同源關系最近的是1Q16，來自大腸桿菌三亞基與1Q16之間均具有6%～100%的覆蓋率，54%～74%的一致性，各對應區(qū)域如圖6(d)所示；圖6(e)是NarJ的蛋白3D結構預測圖，在PDB中預測的唯一同源性3D結構來自家牛(BosTaurus)的蛋白細胞色素B5(Cytochrome B5)(見圖6(f))，但其覆蓋率僅13%，相似性僅44%(見表2)，可能因為PDB庫中相應蛋白質數(shù)據(jù)不全導致比對結果不理想。

(查詢序列 Query seq.；特定匹配 Specific hits；超家族 Superfamilies)

(藍色：α螺旋；紅色：延伸鏈；綠色：β折疊。Blue: α helix; Red: Extended strand; Green: β turn.)

((a)運用Phyre2 預測的NarG的3D模型 3D model of NarG protein predicted using Phyre2;(b)運用Phyre2 預測的NarY的3D模型 3D model of NarY protein predicted using Phyre2; (c)運用Phyre2 預測的NarV的3D模型 3D model of NarV protein predicted using Phyre2; (d)從PDB中檢索的與NarG、NarY和NarV同源性較高的3D模型 3D model with high homology to NarG、NarY andNarV retrieved from PDB; (e)運用Phyre2 預測的NarJ的3D模型 3D model of NarJ protein predicted using Phyre2; (f)從PDB中檢索的與NarJ同源性較高的3D模型 3D model with high homology to NarJ retrieved from PDB.)

圖6 預測的蛋白三級結構Fig.6 Predicted protein tertiary structure

2.4 系統(tǒng)進化樹

基于NCBI網(wǎng)站的BLAST比對結果，根據(jù)narG和narY編碼的氨基酸序列同源性分別構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，可見菌株X3的narG編碼氨基酸與坎帕尼亞鹽單胞菌(Halomonascampaniensis)等的遺傳距離最近，同源性最高，其次是同屬的其他菌，但與其他屬的菌之間同源性較低(見圖7)。由此可見，不同屬的細菌中NarG具有相同的功能，但氨基酸序列差異性較大，同源性差；菌株X3的narY編碼氨基酸與大腸桿菌中的硝酸鹽還原酶的同源性較高(見圖8)。綜上可知，菌株X3的異化型硝酸鹽還原酶Nar的四個亞基在系統(tǒng)發(fā)育樹中的進化程度不同。

圖7 基于NarG同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on the homology of the NarG

圖8 基于NarY同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 Phylogenetic tree based on the homology of the NarY

3 討論

現(xiàn)發(fā)表的細菌硝酸鹽還原系統(tǒng)包括膜結合呼吸性硝酸鹽還原酶(Nar)[22]，周質異化硝酸鹽還原酶(Nap)[23]和細胞質同化硝酸鹽還原酶(Nas)[24]三種系統(tǒng)。Nar錨定于細胞質膜上，主要參與細菌在厭氧條件下的硝酸鹽呼吸通路，主要在厭氧條件下高水平表達；Nap位于細胞周質中，不僅具有硝酸鹽的清除功能，還參與細菌厭氧呼吸下氨化作用和反硝化作用等；Nas位于細胞質中，生理結構比較單一，只參與硝酸鹽的同化還原作用[25]。楊航等[26]發(fā)現(xiàn)全食副球菌(Paracoccuspantotrophus) ATCC 35512中同時存在Nar和Nap兩種硝酸鹽還原酶，在厭氧條件下Nar占主要地位，而好氧條件下Nap是主要存在形式。有的菌同時含有三種酶系統(tǒng)，只是在不同條件下，不同的系統(tǒng)發(fā)揮作用。硝酸鹽還原過程因細菌不同而異，如大腸桿菌等僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；假單胞菌等能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原成氮(反硝化作用)，而有的細菌則可以使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)銨[25]。菌株X3的 KEGG氮代謝途徑顯示其同時具有同化型和異化型硝酸鹽還原途徑，異化型反應的第一步依靠于Nar的催化，因此研究Nar的編碼基因及其蛋白結構是下一步研究其酶的性質和氮代謝路徑選擇機制的基礎。

本文通過測定異化型硝酸鹽還原酶的酶活和qRT-PCR檢測到目的片段的產(chǎn)生，驗證了菌株X3中含有異化型還原酶Nar，但不同的細菌編碼Nar的基因簇中所包含的基因也有所不同，全基因組測序預測菌株X3中nar基因簇包括narG、narY、narJ、narV四個基因，這與大腸桿菌和SalmonellaentericaserovarGallinarum的narGHJI不同[9-10]。對菌株X3narGYJV基因簇進行生物信息學分析，預測到其編碼的四個蛋白結構域，其中1～1 246氨基酸屬于NarG超家族，編碼Nar的α亞基；1 261～1 752氨基酸屬于DMSOR-beta-like 超家族，編碼Nar的β亞基；2 061～2 279氨基酸編碼γ亞基，1 802～2 018氨基酸編碼δ亞基。檢測到該氨基酸無信號肽，這與Nar是附著于胞質側膜上的三亞基復合酶[27]描述相符。在蛋白質3D結構預測中，NarG、NarY和NarV的三級結構模型均與大腸桿菌中的硝酸鹽還原酶A相似度較高，但NarJ相似度很低，需要進一步研究，這也與Blasco等主張的大腸桿菌的硝酸鹽還原酶是由NarG、NarH、和NarI三亞基組成的，但第四個亞基NarJ是該酶連接鉬因子的特殊結構，與編碼該酶的活性部位不一致[28]。系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，雖然NarG在許多菌屬的細菌中存在，并執(zhí)行相同的催化功能，但不同菌屬間該基因的同源性不高，相同菌屬間的遺傳距離較近，其中與Halomonascampaniensis和鹽單胞菌屬(Halomonassp.) WN018的一致性均高達99%，但不同的菌屬間該基因的同源性并不高；而NarY的高同源性主要表現(xiàn)在大腸桿菌中，可能是因為Nar中各亞基的進化程度不同，或與PDB數(shù)據(jù)庫中與本菌Nar相關的基因及其蛋白相關的蛋白質結構數(shù)據(jù)不足有關，需要進一步研究，擴充PDB數(shù)據(jù)庫。本文的研究結果也為進一步研究菌株X3及具有同類功能細菌的酶性質、氮代謝機理和氮代謝路徑的選擇機制奠定了基礎。

4 結語

HalomonasalkaliphilaX3氮代謝通路中存在異化型硝酸鹽還原酶Nar，它催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。Nar由四個亞基構成，分別由基因narG、narY、narJ和narV編碼。HalomonasalkaliphilaX3的異化型硝酸鹽還原酶NarG的氨基酸序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中顯示與同菌屬的NarG同源關系較近，尤其與Halomonascampaniensis和Halomonassp. WN018的一致性均高達99%，且不同亞基的系統(tǒng)發(fā)育地位不同。研究結果為進一步深入研究嗜堿鹽單胞菌的氮代謝通路選擇和調(diào)控機制提供了依據(jù)。