王 越， 李秋芬， 張 艷

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306；2.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071)

細(xì)菌的氮代謝是海洋生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)者之一[1]，也是建立生物脫氮技術(shù)的主要依據(jù)[2]，其中硝酸鹽還原是氮代謝中最重要的步驟之一[3]。細(xì)菌的硝酸鹽還原分為異化型和同化型，大多數(shù)脫氮細(xì)菌同時(shí)具有同化硝酸鹽還原途徑和異化硝酸鹽還原途徑[4]，如海桿菌(Marinobactersp. )NY-4[5]。異化型的硝酸鹽還原又包括硝酸鹽異化還原成銨和微生物在厭氧條件下將硝酸鹽還原為N2、N2O或NO的反硝化作用，這2種途徑的第一步都是在異化型硝酸鹽還原酶(Dissimilatory nitrate reductase，Nar)的作用下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)步驟，可見異化型硝酸鹽還原酶是生物脫氮過(guò)程中的關(guān)鍵酶[6-7]。據(jù)報(bào)道大腸桿菌(Escherichiacoli)和雞腸血清沙門氏桿菌(Salmonellaentericaserovar gallinarum)中將硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽的酶是由基因簇narGHJI編碼的[8-10]，它們分別編碼組成膜內(nèi)Nar的α、β、γ、和δ四個(gè)亞基，其中narG編碼膜內(nèi)Nar的最大結(jié)構(gòu)基因,通常有3 600 bp[11-12]，其活性位點(diǎn)位于向著細(xì)胞質(zhì)一面的細(xì)胞膜表面[13]。Pérezrodríguez 等[14]使用narG基因作為硝酸鹽還原菌的診斷標(biāo)記，來(lái)研究深海熱液區(qū)的微生物群落。Oikawa等[15]通過(guò)構(gòu)建narG的缺失變體確定深海脫氮菌假單胞菌(Pseudomonassp.) MT-1中該基因編碼異化硝酸鹽還原酶，但不同的菌中，構(gòu)成該基因簇的基因也不盡相同，如：有的菌中narH代替了narY、narI代替了narV[16]?；虻牟煌部赡軙?huì)影響該菌的異化硝酸鹽還原酶的結(jié)構(gòu)和功能。

本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得一株海水細(xì)菌X3，具有脫氮功能[17]，后鑒定為嗜堿鹽單胞菌(Halomonasalkaliphila)，研究其脫氮特性和環(huán)境適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)菌株X3可同時(shí)去除氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮[18]，但尚未對(duì)該菌株氮代謝路徑的相關(guān)功能基因做進(jìn)一步研究，也未見有針對(duì)Halomonasalkaliphila功能基因的相關(guān)報(bào)道。本文在前期對(duì)該菌的全基因組測(cè)序(GenBank登錄號(hào)： cp024811)預(yù)測(cè)到其氮代謝通路中含有narGYJV基因簇的基礎(chǔ)上，報(bào)告了對(duì)該菌株氮代謝途徑中nar基因簇功能的驗(yàn)證及編碼的Nar蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果，以期為下一步研究該菌的氮代謝機(jī)理和調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)所用菌株為由本實(shí)驗(yàn)室從海水中分離純化所得的嗜堿鹽單胞菌X3，采用甘油冷凍法保存于-80℃冰箱[19]。

培養(yǎng)基：硝酸鹽還原培養(yǎng)基，參照李洪鵬等的配方[17]，并有所改進(jìn)。具體如下：NH4Cl 0.5g，MgSO40.1g，NaH2PO40.2g，K2HPO40.5g，CaCO31g，F(xiàn)eSO40.1g，KNO31g，F(xiàn)e3PO40.1g，葡萄糖1g，pH=7.8，滅菌海水1 000 mL。

1.1.2 主要藥品與試劑 主要化學(xué)試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；所采用的試劑盒包括：GENMED Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒、GENMED 細(xì)菌異化型硝酸鹽還原酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒、TIANamp Bacteria DNA Kit 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、天根RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、熒光定量的試劑盒Takara One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶活測(cè)定 首先在硝酸鹽還原培養(yǎng)基中，菌株X3擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600(Optical density在600 nm處的吸光值)為0.4～0.8 (即1×107～2×107細(xì)胞/mL)，然后用Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒測(cè)定樣品溶液中的蛋白質(zhì)濃度，測(cè)定方法參照試劑盒的說(shuō)明書，用96孔板微量測(cè)定。再運(yùn)用細(xì)菌異化型硝酸鹽還原酶定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定Nar的酶活，測(cè)定方法按照說(shuō)明書中的酶標(biāo)儀測(cè)定法，先按照操作步驟，利用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立縱坐標(biāo)為吸光值OD540、橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)的亞硝酸鹽濃度，進(jìn)行下列公式的計(jì)算獲得酶活。其中異化型硝酸鹽還原酶的活性單位定義為37 ℃、pH=7.5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1nmol硝酸鹽所需要的酶量為一個(gè)活性單位，計(jì)算公式如下：

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(qRT-PCR) 以硝酸鹽還原培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株X3，運(yùn)用RNA提取試劑盒提取該菌株的總RNA，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的質(zhì)量。引物選用NarG1F、NarG1R (見表1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系采用25 μL：2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5 μL，TaKaRa Ex TaqHS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4 μL，引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，Eva green 0.8 μL，模板1 μL(其中陽(yáng)性對(duì)照為菌株X3的基因組 DNA，陰性對(duì)照為無(wú)菌水，實(shí)驗(yàn)組為總RNA)，RNase Free dH2O 8.9 μL。反應(yīng)時(shí)間為42 ℃，10 min；95 ℃，1 min；95 ℃，10 s；55 ℃，30 s。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用DNAMAN翻譯得到Nar四亞基的各氨基酸序列，通過(guò)ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi) 在線預(yù)測(cè)得到Nar開放閱讀框，然后運(yùn)用在線軟件SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/ SignalP-3.0/) 對(duì)信號(hào)肽和分泌蛋白的有無(wú)進(jìn)行預(yù)測(cè)；并運(yùn)用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 預(yù)測(cè)氨基酸序列有無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，用在線軟件ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/) 分析氨基酸序列組成以及等電點(diǎn)和分子量。運(yùn)用在線軟件NPS Network ProteinSequenceAnalysis (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsaautomat.pl?page=/NPSA/ npsa_sopma.html) 進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析[20]。最后運(yùn)用Phyre2對(duì)四個(gè)基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并在蛋白質(zhì)庫(kù)PDB中檢索同源蛋白[21]；通過(guò)BLAST比對(duì)同源氨基酸序列，運(yùn)用MAGE 5.0構(gòu)建基于narG和narY編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 酶活驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)酶活性測(cè)試驗(yàn)證了narGYJV基因簇存在的可能性及其功能。培養(yǎng)菌株X3至OD600=0.7時(shí)，測(cè)得蛋白質(zhì)濃度為0.013 μg/μL，且在OD540處的吸光度為0.082，根據(jù)圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得樣品中亞硝酸鹽濃度為5.618 μmol/L，將數(shù)值代入1.2.1的酶活力公式進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)對(duì)酶活單位的定義，得出菌株X3的異化硝酸鹽還原酶為每克蛋白21.415 U。

圖1 異化型硝酸鹽還原酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the enzyme activity of the dissimilatory nitrate reductase

2.2 轉(zhuǎn)錄水平上的驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)菌株X3的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果 (見圖2)顯示菌株X3的RNA可以擴(kuò)增得到目的片段，且CT值約為27，證明了narGYJV基因簇在X3中存在并具有表達(dá)活性。圖3中的熔解曲線具有單一峰，證明所用引物具有特異性。

(a.陽(yáng)性對(duì)照；b.樣品；c.陰性對(duì)照。a.Positive control; b. Sample; c.Negative control.)

圖2 qRT-PCR結(jié)果
Fig.2 qRT-PCR results

2.3 生物信息學(xué)分析

據(jù)全基因組測(cè)序獲得的菌株X3的異化型硝酸鹽還原酶基因簇中4個(gè)基因narG、narY、narJ和narV的序列(GenBank登錄號(hào)：MG776025～MG776028)，全序列翻譯得到2 280個(gè)氨基酸，在該氨基酸序列中檢測(cè)到4個(gè)蛋白功能域，1～1 246氨基酸屬于NarG超家族，編碼Nar的α亞基；1 261～1 752氨基酸屬于DMSOR-beta-like 超家族，編碼Nar的β亞基；2 061～2 279氨基酸 編碼γ亞基，1 802～2 018氨基酸編碼δ亞基(見圖4)。經(jīng)軟件TMHMM Server和ProtParam tool分析，此氨基酸序列沒有信號(hào)肽但有跨膜結(jié)構(gòu)，等電點(diǎn)為5.86，分子量256 453.72 Da，帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp + Glu) 289個(gè)，占總蛋白的12.7%，帶正電荷的氨基酸(Arg + Lys) 242個(gè)，占總蛋白的10.6%，蛋白序列中有36個(gè)半胱氨酸，不穩(wěn)定系數(shù)是40.20，是一種不穩(wěn)定蛋白，脂溶性為79.77，總平均親水性為-0.341。NPS Network Protein Sequence Analysis預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示無(wú)規(guī)卷曲占37.59%，α螺旋占34.43%，延伸鏈占18.33% (見圖5)。

(a.陽(yáng)性對(duì)照；b.樣品；c.陰性對(duì)照。 a.Positive control; b. Sample; c.Negative control.)

圖3 qRT-PCR熔解曲線
Fig.3 Melting curve of qRT-PCR

結(jié)合圖6和表2分析NarGYJV的蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，Phyre2預(yù)測(cè)的NarG、NarY和NarV蛋白3D結(jié)構(gòu)(見圖6(a)、(b)、(c))，在PDB中同源關(guān)系最近的是1Q16，來(lái)自大腸桿菌三亞基與1Q16之間均具有6%～100%的覆蓋率，54%～74%的一致性，各對(duì)應(yīng)區(qū)域如圖6(d)所示；圖6(e)是NarJ的蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖，在PDB中預(yù)測(cè)的唯一同源性3D結(jié)構(gòu)來(lái)自家牛(BosTaurus)的蛋白細(xì)胞色素B5(Cytochrome B5)(見圖6(f))，但其覆蓋率僅13%，相似性僅44%(見表2)，可能因?yàn)镻DB庫(kù)中相應(yīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)不全導(dǎo)致比對(duì)結(jié)果不理想。

(查詢序列 Query seq.；特定匹配 Specific hits；超家族 Superfamilies)

(藍(lán)色：α螺旋；紅色：延伸鏈；綠色：β折疊。Blue: α helix; Red: Extended strand; Green: β turn.)

((a)運(yùn)用Phyre2 預(yù)測(cè)的NarG的3D模型 3D model of NarG protein predicted using Phyre2;(b)運(yùn)用Phyre2 預(yù)測(cè)的NarY的3D模型 3D model of NarY protein predicted using Phyre2; (c)運(yùn)用Phyre2 預(yù)測(cè)的NarV的3D模型 3D model of NarV protein predicted using Phyre2; (d)從PDB中檢索的與NarG、NarY和NarV同源性較高的3D模型 3D model with high homology to NarG、NarY andNarV retrieved from PDB; (e)運(yùn)用Phyre2 預(yù)測(cè)的NarJ的3D模型 3D model of NarJ protein predicted using Phyre2; (f)從PDB中檢索的與NarJ同源性較高的3D模型 3D model with high homology to NarJ retrieved from PDB.)

圖6 預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Predicted protein tertiary structure

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹

基于NCBI網(wǎng)站的BLAST比對(duì)結(jié)果，根據(jù)narG和narY編碼的氨基酸序列同源性分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，可見菌株X3的narG編碼氨基酸與坎帕尼亞鹽單胞菌(Halomonascampaniensis)等的遺傳距離最近，同源性最高，其次是同屬的其他菌，但與其他屬的菌之間同源性較低(見圖7)。由此可見，不同屬的細(xì)菌中NarG具有相同的功能，但氨基酸序列差異性較大，同源性差；菌株X3的narY編碼氨基酸與大腸桿菌中的硝酸鹽還原酶的同源性較高(見圖8)。綜上可知，菌株X3的異化型硝酸鹽還原酶Nar的四個(gè)亞基在系統(tǒng)發(fā)育樹中的進(jìn)化程度不同。

圖7 基于NarG同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on the homology of the NarG

圖8 基于NarY同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 Phylogenetic tree based on the homology of the NarY

3 討論

現(xiàn)發(fā)表的細(xì)菌硝酸鹽還原系統(tǒng)包括膜結(jié)合呼吸性硝酸鹽還原酶(Nar)[22]，周質(zhì)異化硝酸鹽還原酶(Nap)[23]和細(xì)胞質(zhì)同化硝酸鹽還原酶(Nas)[24]三種系統(tǒng)。Nar錨定于細(xì)胞質(zhì)膜上，主要參與細(xì)菌在厭氧條件下的硝酸鹽呼吸通路，主要在厭氧條件下高水平表達(dá)；Nap位于細(xì)胞周質(zhì)中，不僅具有硝酸鹽的清除功能，還參與細(xì)菌厭氧呼吸下氨化作用和反硝化作用等；Nas位于細(xì)胞質(zhì)中，生理結(jié)構(gòu)比較單一，只參與硝酸鹽的同化還原作用[25]。楊航等[26]發(fā)現(xiàn)全食副球菌(Paracoccuspantotrophus) ATCC 35512中同時(shí)存在Nar和Nap兩種硝酸鹽還原酶，在厭氧條件下Nar占主要地位，而好氧條件下Nap是主要存在形式。有的菌同時(shí)含有三種酶系統(tǒng)，只是在不同條件下，不同的系統(tǒng)發(fā)揮作用。硝酸鹽還原過(guò)程因細(xì)菌不同而異，如大腸桿菌等僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；假單胞菌等能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原成氮(反硝化作用)，而有的細(xì)菌則可以使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)銨[25]。菌株X3的 KEGG氮代謝途徑顯示其同時(shí)具有同化型和異化型硝酸鹽還原途徑，異化型反應(yīng)的第一步依靠于Nar的催化，因此研究Nar的編碼基因及其蛋白結(jié)構(gòu)是下一步研究其酶的性質(zhì)和氮代謝路徑選擇機(jī)制的基礎(chǔ)。

本文通過(guò)測(cè)定異化型硝酸鹽還原酶的酶活和qRT-PCR檢測(cè)到目的片段的產(chǎn)生，驗(yàn)證了菌株X3中含有異化型還原酶Nar，但不同的細(xì)菌編碼Nar的基因簇中所包含的基因也有所不同，全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)菌株X3中nar基因簇包括narG、narY、narJ、narV四個(gè)基因，這與大腸桿菌和SalmonellaentericaserovarGallinarum的narGHJI不同[9-10]。對(duì)菌株X3narGYJV基因簇進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)到其編碼的四個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，其中1～1 246氨基酸屬于NarG超家族，編碼Nar的α亞基；1 261～1 752氨基酸屬于DMSOR-beta-like 超家族，編碼Nar的β亞基；2 061～2 279氨基酸編碼γ亞基，1 802～2 018氨基酸編碼δ亞基。檢測(cè)到該氨基酸無(wú)信號(hào)肽，這與Nar是附著于胞質(zhì)側(cè)膜上的三亞基復(fù)合酶[27]描述相符。在蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，NarG、NarY和NarV的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型均與大腸桿菌中的硝酸鹽還原酶A相似度較高，但NarJ相似度很低，需要進(jìn)一步研究，這也與Blasco等主張的大腸桿菌的硝酸鹽還原酶是由NarG、NarH、和NarI三亞基組成的，但第四個(gè)亞基NarJ是該酶連接鉬因子的特殊結(jié)構(gòu)，與編碼該酶的活性部位不一致[28]。系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，雖然NarG在許多菌屬的細(xì)菌中存在，并執(zhí)行相同的催化功能，但不同菌屬間該基因的同源性不高，相同菌屬間的遺傳距離較近，其中與Halomonascampaniensis和鹽單胞菌屬(Halomonassp.) WN018的一致性均高達(dá)99%，但不同的菌屬間該基因的同源性并不高；而NarY的高同源性主要表現(xiàn)在大腸桿菌中，可能是因?yàn)镹ar中各亞基的進(jìn)化程度不同，或與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中與本菌Nar相關(guān)的基因及其蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)不足有關(guān)，需要進(jìn)一步研究，擴(kuò)充PDB數(shù)據(jù)庫(kù)。本文的研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究菌株X3及具有同類功能細(xì)菌的酶性質(zhì)、氮代謝機(jī)理和氮代謝路徑的選擇機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)語(yǔ)

HalomonasalkaliphilaX3氮代謝通路中存在異化型硝酸鹽還原酶Nar，它催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。Nar由四個(gè)亞基構(gòu)成，分別由基因narG、narY、narJ和narV編碼。HalomonasalkaliphilaX3的異化型硝酸鹽還原酶NarG的氨基酸序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中顯示與同菌屬的NarG同源關(guān)系較近，尤其與Halomonascampaniensis和Halomonassp. WN018的一致性均高達(dá)99%，且不同亞基的系統(tǒng)發(fā)育地位不同。研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究嗜堿鹽單胞菌的氮代謝通路選擇和調(diào)控機(jī)制提供了依據(jù)。