譚 軍，羅桂杰，馬柏林，劉 博，殷 青，

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800；2.宿遷市宿豫區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇 宿遷 223800；3.江蘇省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校 沭陽(yáng)分校，江蘇 沭陽(yáng) 223600）

果桑是多年生木本植物，屬于落葉樹種，主要分布于溫帶和亞熱帶地區(qū)。我國(guó)果桑主要分布在江蘇、廣東、廣西、湖北、陜西等?。ㄗ灾螀^(qū)）。果桑藥食兩宜，享有“21世紀(jì)最佳保健果品”“果中珍品”“民間圣果”“中華果王”等美譽(yù)[1]。果桑品種白玉王樹形開展，枝條細(xì)直，葉較小，花芽率高，果長(zhǎng)3.5～4.0 cm，果徑1.5 cm左右，長(zhǎng)筒形，單果重4～5 g，最大10 g，果色乳白色，汁多，甜味濃，含糖量高達(dá)20%，適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱耐寒，是大果型葉果兼用品種。近年來(lái)，隨著人們營(yíng)養(yǎng)保健意識(shí)的逐漸增強(qiáng)和對(duì)果品需求的多樣化，促進(jìn)了果桑的發(fā)展。因此，開發(fā)利用果桑具有廣闊的市場(chǎng)前景。

ANIS 等[2]和SHAMMA 等[3]對(duì)桑樹組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，經(jīng)過(guò)多年努力構(gòu)建了一套完整的桑樹組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系。隨后，楊海霞等[4]和劉健等[5]以莖尖、葉（芽）、胚珠、花藥等作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究。但國(guó)內(nèi)未見運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)果桑白玉王進(jìn)行工廠化育苗的報(bào)道。因此，筆者對(duì)果桑白玉王進(jìn)行了組織培育快繁技術(shù)研究，并在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同種類不同濃度的激素，觀察組培苗的生長(zhǎng)狀況，旨在找到影響無(wú)菌苗生長(zhǎng)發(fā)育的制約因子和最佳使用濃度，篩選出適于果桑白玉王組培苗快速生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基，從而為工廠化育苗提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

果桑白玉王采摘于江蘇省沭陽(yáng)縣東小店鄉(xiāng)店?yáng)|村果桑種植園，取當(dāng)年生、健壯無(wú)病蟲害的嫩枝條上帶側(cè)芽的莖段，作為外植體。

1.2 培養(yǎng)條件

外植體的腋芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)都在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，MS基本培養(yǎng)基加入30g/L 蔗糖和7.0g/L 瓊脂，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH值為5.8，110℃高壓濕熱滅菌30 min后備用。培養(yǎng)室溫度控制在（25±2）℃，日光燈光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的光照時(shí)間為8～10 h/d，增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的光照時(shí)間均為10～12 h/d。

1.3 外植體前處理

每個(gè)外植體剪成3～4 cm 段，每段至少有一個(gè)側(cè)芽，先用2%洗衣粉浸泡10 min 去除表面污垢后[6]，再用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗1 h[7]。

1.4 外植體滅菌消毒

對(duì)植物材料進(jìn)行前處理后，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)進(jìn)行消毒處理：75%的酒精滅菌30 s，然后用0.1%的HgCl2（俗稱升汞）為其加0.01 mL 吐溫80浸泡，時(shí)間分別為2，4，6，8，10，12 min，再用無(wú)菌水沖洗5 遍，最后用無(wú)菌濾紙吸干，將植物材料接種到培養(yǎng)基中，每瓶接1個(gè)。

1.5 不同培養(yǎng)基的篩選

在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入不同濃度的6-BA（6-芐基腺嘌呤）、IBA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）篩選最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度。

腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選：在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入6-BA，濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0mg/L；加入IBA濃度分別為0.5，1.5，2.5，3.5mg/L，各處理組合見表1。

表1 不同激素濃度配比的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基的篩選：在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入6-BA，濃度分別為0.5，1.5，2.5，3.5mg/L；加入IBA，濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0mg/L，各處理組合見表2。

生根培養(yǎng)基的篩選：在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入NAA，濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0mg/L。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體不同消毒時(shí)間對(duì)白玉王成活率的影響

由表3可知，采用0.1% HgCl2對(duì)外植體進(jìn)行消毒，由于浸泡時(shí)間不同，接種后外植體污染率、死亡率和成活率出現(xiàn)顯著差異。0.1% HgCl2浸泡2 min時(shí)，滅菌不徹底，污染率高達(dá)97%，該處理下最先表現(xiàn)出污染，在培養(yǎng)第5 天外植體下端的培養(yǎng)基表面產(chǎn)生菌落，表明該處理消毒效果較差。0.1%HgCl2浸泡10 min時(shí)，污染率最低僅為30.21%，顯著低于其他各處理（P＜0.05），該處理的外植體在培養(yǎng)10 d時(shí)側(cè)芽開始萌動(dòng)，培養(yǎng)至25 d，每株有側(cè)芽1～2個(gè)，成活率最高為55.97%，顯著高于其他各處理（P＜0.05）。結(jié)果表明：75%的酒精滅菌30 s+0.1%的HgCl2+0.01 mL吐溫80+浸泡10 min，外植體滅菌效果最佳。

表2 不同激素濃度配比增殖培養(yǎng)基

表3 0.1%HgCl2 不同消毒時(shí)間對(duì)白玉王成活率的影響

2.2 不同激素濃度對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

由表4可知，根據(jù)K值的大小，由極差RC2值可以判斷影響腋芽誘導(dǎo)的激素水平是6-BA＞IBA，說(shuō)明6-BA濃度是影響腋芽誘導(dǎo)的最主要因素，其次是IBA的濃度。當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L、IBA濃度為1.5mg/L時(shí)，雖然誘導(dǎo)率不是最高，但是腋芽誘導(dǎo)的效果最好，此時(shí)芽分化率高、芽苗粗壯。當(dāng)IBA濃度升高時(shí)，雖然誘導(dǎo)率升高，但莖段下端產(chǎn)生大量愈傷組織進(jìn)而發(fā)育為纖細(xì)瘦弱的不定芽，難以保證增殖苗的質(zhì)量。因此，促進(jìn)腋芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.0mg/L6-BA+1.5mg/LIBA。

表4 不同激素濃度配比對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素濃度對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

由表5可知，IBA濃度是影響增殖培養(yǎng)最主要因素，其次是6-BA的濃度。隨著IBA的濃度的升高，增殖系數(shù)隨之下降，說(shuō)明IBA對(duì)白玉王莖段的生長(zhǎng)和分化有抑制作用，隨著IBA濃度的增加，白玉王莖段的生長(zhǎng)和分化反而減緩，所以IBA的取量不宜過(guò)高。其次是6-BA的作用，對(duì)組培苗增殖有顯著影響（P＜0.05），隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)先升高后降低，當(dāng)6-BA濃度高于2.5mg/L時(shí)，幼苗呈褐化及玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，因此6-BA的濃度不宜過(guò)高。MS+2.5mg/L6-BA+0.5mg/LIBA組合分化率和增殖系數(shù)均最高。綜上所述，無(wú)菌苗增殖最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.5mg/L6-BA+0.5mg/LIBA。

表5 不同激素濃度對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

2.4 不同濃度NAA對(duì)生根培養(yǎng)的影響

由表6可知，在1/2MS 中加入不同濃度的NAA在誘導(dǎo)組培苗生根方面差異極顯著（P＜0.01），NAA濃度為0.5mg/L時(shí)誘導(dǎo)組培苗生根率最高，為95.16%，顯著高于其他各處理（P＜0.05）。將組培無(wú)根苗接入生根培養(yǎng)基15～20 d后，從試管苗剪口基部長(zhǎng)出5～8 條嫩白色的幼根，40 d后長(zhǎng)出完整根系。由此確定，誘導(dǎo)生根率最高的培養(yǎng)基配方為1/2 MS+0.5mg/LNAA。

表6 不同濃度NAA對(duì)生根培養(yǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

建立無(wú)菌體系的過(guò)程中，采用75%的酒精滅菌30 s+0.1%HgCl2+0.01 mL吐溫80+浸泡10 min，外植體滅菌效果最佳。外植體消毒和培養(yǎng)感染是果桑離體再生技術(shù)建立的關(guān)鍵，最初在果桑無(wú)菌體系建立過(guò)程中選用NaClO[8]，效果不是很理想，由于NaClO 和HgCl2相比，滲透性差，消毒不徹底[9]。0.1% HgCl2處理時(shí)間越短，消毒不徹底，外植體污染率越高；若0.1% HgCl2消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雖然污染率降低，但外植體受到傷害，褐化死亡率增加。因此，消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

在生長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，植物激素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)于組織離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及其調(diào)控起著十分關(guān)鍵的作用[10]。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中需要添加植物激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，不同植物或同一植物不同品種所需要添加植物激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度各不相同。試驗(yàn)表明，不同桑樹品種在組織培養(yǎng)過(guò)程中所需植物激素濃度有明顯差別[11-13]。本試驗(yàn)探索了在培養(yǎng)基中添加不同激素種類和濃度對(duì)果桑白玉王細(xì)胞誘導(dǎo)分化、生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，6-BA 濃度的高低是影響腋芽誘導(dǎo)的最主要因素，當(dāng)6-BA 濃度為2.0 mg/L、IBA 濃度為1.5 mg/L 時(shí)，腋芽誘導(dǎo)的效果最好。這與馬鳳桐等[14]的試驗(yàn)結(jié)果不一致，馬鳳桐等[14]研究認(rèn)為，細(xì)胞分裂素是桑芽（莖頂）培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。這可能是由于果桑品種本身的遺傳生理生化特性的不同所引起的，具體原因需要進(jìn)一步試驗(yàn)、探索研究。

IBA濃度是影響果桑白玉王無(wú)菌苗增殖培養(yǎng)最主要的因素，IBA濃度的升高對(duì)無(wú)菌苗增殖有抑制作用，當(dāng)6-BA濃度高于2.5mg/L時(shí)，幼苗呈褐化及玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重。玻璃化現(xiàn)象是由于滲透勢(shì)不均衡造成的，使植物細(xì)胞大量吸水，充滿水分的細(xì)胞分子堆積在一起，導(dǎo)致植物組織透明發(fā)亮[15]。當(dāng)6-BA濃度高于2.5mg/L時(shí)，會(huì)造成培養(yǎng)基的滲透勢(shì)改變，使植物體內(nèi)部的滲透勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于培養(yǎng)基的滲透勢(shì)，造成植物組織大量吸水，發(fā)生試管苗玻璃化現(xiàn)象，其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

在植物生根過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)MS 營(yíng)養(yǎng)成分減半對(duì)新梢生根有極大影響，由于1/2MS 使無(wú)機(jī)鹽離子濃度減低，滲透壓減小，進(jìn)而促進(jìn)根原基的形成。因此，選用1/2MS 作為基本培養(yǎng)基，同時(shí)加入0.5mg/LNAA，誘導(dǎo)組培苗生根率最高。這與大山圣夫等[16]的研究結(jié)果大體一致，他們認(rèn)為添加1mg/LNAA 有利于試管苗的生根，同時(shí)片桐幸逸[17]對(duì)桑不定芽的生根進(jìn)行了研究，完善了果桑的再生體系。果桑白玉王組培苗的大田種植適應(yīng)性、產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)還需要進(jìn)一步研究。