郝麗芬，燕孟嬌，房永雨，宋培玲，皇甫海燕，郭 晨，楊永青，賈曉清，皇甫九茹，李子欽

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

植物在自然界生長，不可避免地要受到病原菌的侵染，促成了植物與病原菌的協(xié)同進(jìn)化，人們已經(jīng)認(rèn)識到來自病原菌的效應(yīng)子蛋白和來自植物的抗性蛋白（或次級代謝物）可以在植物和微生物之間轉(zhuǎn)運(yùn)，但是，近年研究證明，小RNA（sRNAs）也可以在不同生物界之間相互轉(zhuǎn)運(yùn)，并且跨界沉默對方的靶基因。這種沉默靶基因的機(jī)制被命名為跨界RNA 干擾[1]。

sRNAs以兩種形式存在，微小RNA（microRNA，miRNA）和小干擾RNA（siRNA）。一般情況下，miRNA 起源于含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA；而siRNA起源于長的雙鏈RNA的顛倒重復(fù)或依賴RNA的RNA 聚合酶（Rd RP）產(chǎn)物。siRNA 又可以根據(jù)其起源的路徑不同分為反式作用siRNA（ta-siRNAs）、次級階段siRNA（phasiRNAs）、異染色質(zhì)siRNA（hcsiRNAs）、自然反轉(zhuǎn)錄siRNA（nat-siRNAs）和長鏈siRNAs（lsiRNAs）。ta-siRNAs 研究較深入，已經(jīng)明確其在植物免疫和信號傳導(dǎo)過程中具有重要功能[2]。研究也表明，22 nt miRNA和phasiRNAs可以靶向抑制NLR 基因和PRRs 基因，在平衡植物的抗性和生長中起調(diào)控作用[3-4]，hc-siRNAs 長度一般為24～30 nt，主要介導(dǎo)植物表觀遺傳[5]。lsiRNAs 長度一般為30～40 nt，研究發(fā)現(xiàn)其也參與植物抗性反應(yīng)[6]。多項(xiàng)研究證明，miRNA和siRNA 在植物病原菌互作過程中發(fā)揮重要作用。2013年，sRNAs 首先在灰霉病菌與擬南芥、番茄的互作過程中被發(fā)現(xiàn)[7]，隨后，科學(xué)家在多種植物和病原菌的互作過程中發(fā)現(xiàn)有sRNAs的參與，并將這種sRNAs 介導(dǎo)的寄主誘導(dǎo)基因沉默（HIGS）技術(shù)成功應(yīng)用在植物保護(hù)工作中。筆者主要綜述了sRNAs 合成路徑和作用機(jī)理及其在寄主與病原菌互作過程中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和應(yīng)用實(shí)例的研究進(jìn)展，以期為跨界RNA 干擾技術(shù)在植物病害防控領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供參考信息。

1 跨界sRNAs的合成路徑

sRNAs 由于起源的路徑不同，合成路徑也不同。miRNAs 利用RNA 聚合酶Ⅱ（RNAPol Ⅱ）轉(zhuǎn)錄miRNA 基因產(chǎn)生原初miRNA，原初miRNA 轉(zhuǎn)錄形成折回結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步加工形成帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA（Pri-miRNA），由DICER 類蛋白1（DCL1）和HYL1（Hyponastic leaves 1）和SE（Serrate）作用形成雙重sRNAs，被HEN1（Huenhancer 1）在3′端甲基化，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，成熟的miRNA 會優(yōu)先與AGO1 （Argonaute1） 蛋白結(jié)合，靶向切割目標(biāo)mRNA[8]。

而siRNAs 來源于不完全配對的雙鏈RNA（dsRNA）前體，其他來源于反義轉(zhuǎn)錄或RNA 依賴的RNA 聚合酶產(chǎn)物，RNAPol Ⅱ轉(zhuǎn)錄非編碼TAS 基因，借助miRNAs和RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISCs）切割原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，產(chǎn)生5′片段和3′片段，在RDR6和SGS3 作用下，以產(chǎn)生的片段為模板合成互補(bǔ)鏈，形成雙鏈RNA，再由DCL4和DRB4 作用形成ta-siRNAs。正義和反義轉(zhuǎn)錄cis-NATs 產(chǎn)生nat-siRNAs，參與的細(xì)胞組分有DCL1 或DCL2，HYL1和HEN1[9]。而hc-siRNAs和ta-siRNAs 一般來源于轉(zhuǎn)座子、重復(fù)原件和異染色質(zhì)區(qū)，合成依賴于DCL3-RDR2-Pol Ⅳ路徑。而lsiRNAs的合成依賴于DCL1、HYL1、HEN1、AGO7、HST的共同作用，部分依賴于RDR6和Pol Ⅳ組分作用[8]。

成熟的miRNA和siRNAs與AGO蛋白結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）；活化的RISC以堿基互補(bǔ)配對的方式與靶mRNA 相結(jié)合，在酶的作用下將靶mRNA 切割降解或抑制其翻譯，行使其抑制靶基因表達(dá)的功能；RNA 沉默中還存在級聯(lián)放大效應(yīng)，即以siRNA 中的一條鏈為引物，以mRNA為模板，在RNA 依賴的RNA 聚合酶（Rd RP）的作用下合成新的ds RNA，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的循環(huán)擴(kuò)大反應(yīng)[10]。

2 跨界sRNAs的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

植物分泌蛋白的方式分為傳統(tǒng)分泌方式和非經(jīng)典分泌方式。傳統(tǒng)方式是蛋白質(zhì)經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑將蛋白分泌到質(zhì)膜和細(xì)胞外；非經(jīng)典分泌方式（Unconventional protein secretion，UPS）[11]包括多種途徑，其中參與植物免疫的途徑有高爾基體旁路和特異細(xì)胞器介導(dǎo)的3種分泌方式，包括多泡體（MVB）、中心液泡（Central vacuole）和植物特異胞外陽性細(xì)胞器（Plant specific exocyst-positive organelles，EXPO）。植物胞外囊泡主要來源于MVB和EXPO與細(xì)胞膜的融合，參與植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)。胞外囊泡是小的膜封閉的囊泡隔室，胞外囊泡的主要功能是消除細(xì)胞內(nèi)廢物，被細(xì)胞釋放到外界傳送蛋白、RNA、代謝物和其他分子?；谖锓N起源路徑和生物標(biāo)記物，胞外囊泡分為3 類，分別是外來體、細(xì)胞微泡和凋亡體；外來體起源于管腔內(nèi)的多泡體，細(xì)胞微泡是質(zhì)膜向外形成的芽體，凋亡體的細(xì)胞凋亡過程產(chǎn)生的囊泡[12]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，胞外囊泡是植物與病原菌交流的最主要途徑[13]。20世紀(jì)60年代首次發(fā)現(xiàn)植物胞外囊泡[14]，2009年，首次從向日葵種子分離獲得，這些胞外囊泡可以在離體條件下被核盤菌吸入，導(dǎo)致核盤菌形態(tài)改變、細(xì)胞死亡或生長停滯[15]，這表明胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）可以轉(zhuǎn)運(yùn)植物的抗性物質(zhì)到病原菌。

胞外囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)小RNA分子主要包括3種方式[16]。MVB 釋放TET8/9 相關(guān)的外來體到細(xì)胞外空間，包含抗性相關(guān)的分子和寄主的小RNA。這些分子可以被病原菌內(nèi)化抑制其毒性，例如，MVB 參與擬南芥對大麥白粉病菌（Blumeria graminis）的非宿主抗性反應(yīng)。EXPO 是單層膜結(jié)合的胞外泡囊，可能與抗性分子的重新定位相關(guān)。另外，長10～17 nt 短非編碼的sRNAs分子，可以通過PEN1 相關(guān)的囊泡傳輸，但不清楚是否和植物免疫有關(guān)。這3種胞外囊泡是獨(dú)立存在的[17]。

研究發(fā)現(xiàn)，包含寄主sRNAs的植物外來體可以被真菌細(xì)胞在幾小時(shí)內(nèi)吸收，從含有胞外囊泡，并被葡萄孢霉菌感染的植物組織中分離葡萄孢霉（B.cinerea）原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)包含70%的植物sRNAs，這些研究證明胞外囊泡參與介導(dǎo)sRNAs的轉(zhuǎn)運(yùn)。敲除擬南芥TET8/9 會抑制寄主sRNAs的傳輸[18]，HOU 等[19]研究發(fā)現(xiàn)疫霉菌侵染擬南芥的過程中，大量siRNAs 存在于胞外囊泡中，不參與調(diào)控內(nèi)源性植物基因，推測可能沉默疫霉菌的基因。因?yàn)樵谝呙咕幸胫参飐iRNAs，導(dǎo)致疫霉菌發(fā)育缺陷和毒力喪失，而擬南芥的siRNAs 缺陷的突變體對疫霉菌是敏感的，說明胞外囊泡中的siRNAs可以轉(zhuǎn)移到疫霉菌。

3 sRNAs 參與植物與病原菌互作的研究進(jìn)展

3.1 寄主內(nèi)源sRNAs 轉(zhuǎn)運(yùn)至病原菌

寄主植物與病原菌最初始的互作是激活植物先天免疫系統(tǒng)，由病原相關(guān)分子模式激發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)蛋白激發(fā)的免疫反應(yīng)（Effector-triggered immunity，ETI）組成。PTI 反應(yīng)是植物識別病原相關(guān)分子模式（PAMP），主要為病原菌細(xì)胞壁組分（幾丁質(zhì)、鞭毛蛋白等），產(chǎn)生非特異性的防衛(wèi)反應(yīng)。ETI 反應(yīng)是病原菌分泌效應(yīng)子進(jìn)入寄主細(xì)胞，引起寄主產(chǎn)生抗性蛋白，產(chǎn)生特異性的防衛(wèi)反應(yīng)。而sRNAs 廣泛存在于生物體中，在植物與病原菌的互作過程中發(fā)揮重要作用。NAVARRO ET 等[20]首次發(fā)現(xiàn)miRNA 參與植物免疫反應(yīng)，表明擬南芥miR393 被PAMP 誘導(dǎo)產(chǎn)生，可以降低植物生長激素信號強(qiáng)度，引起PTI 反應(yīng)。KATIYAR-AGARWAL 等[2]首次發(fā)現(xiàn)siRNA 參與植物免疫反應(yīng)，證明細(xì)菌丁香假單孢菌（Pseudomonas syringae）誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生nat-siRNAATGB2，攜帶效應(yīng)子AvrRpt2，促進(jìn)ETI 反應(yīng)。ZHANG 等[21]鑒定得到兩個(gè)靶向真菌致病基因的棉花miRNAs（miR166和miR159），兩個(gè)致病基因分別編碼Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白酶（VdClp-1）和異木霉素C-15 羥化酶（VdHiC-15），輸入兩個(gè)miRNA 至棉花，誘導(dǎo)sRNAs跨界干擾兩個(gè)致病基因的表達(dá)，增加了棉花對Verticillium的抗性。XU 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）的G 蛋白信號（RGS）調(diào)控因子受病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，將其中的VdRGS1 基因敲除獲得轉(zhuǎn)基因菌株，發(fā)現(xiàn)病原菌在孢子產(chǎn)生、菌絲發(fā)育、微菌核形成方面受到嚴(yán)重影響，判斷VdRGS1 基因?qū)甑亩玖π纬善痍P(guān)鍵作用。在此基礎(chǔ)上，利用病毒介導(dǎo)的HIGS 技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因棉花，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因棉花對Verticillium dahliae的抗性增強(qiáng)。針對VdRGS1 基因的HIGS 技術(shù)提供了有效防治棉花黃萎病的新思路。

3.2 病原菌內(nèi)源sRNAs 轉(zhuǎn)運(yùn)至寄主植物

近年來，研究發(fā)現(xiàn)sRNAs 在調(diào)控病原菌毒性中發(fā)揮重要作用，可以作為一種新的效應(yīng)子抑制寄主免疫，原核病原菌和真核病原菌都產(chǎn)生了大量的非編碼sRNAs，當(dāng)然，原核的sRNAs 顯著不同于真核sRNAs。細(xì)菌的非編碼sRNAs 是多樣化的，長度在50 ～300 nt，大多數(shù)調(diào)控翻譯效率和穩(wěn)定靶向mRNAs，例如，黃單孢菌屬（Xanthomonas）、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）和果膠桿菌屬（Pectobacterium）的非編碼sRNAs 響應(yīng)脅迫和調(diào)控病原菌毒力[23-25]。

關(guān)于真核病原菌致病相關(guān)的sRNAs 研究較多，在水稻稻瘟病研究中發(fā)現(xiàn)，大量sRNAs 在附著胞中富集[26]，還有灰霉病菌（B.cinerea）在感染初期產(chǎn)生大量的sRNAs，說明sRNAs 是參與植物防御反應(yīng)的重要成員。真菌灰霉病菌（B.cinerea）、大麗輪枝菌（V.dahlia）和卵菌（Oomycete）產(chǎn)生sRNAs 效應(yīng)子，可以移動到寄主細(xì)胞，并且利用寄主RNAi 機(jī)制結(jié)合到寄主AGO1 或者沉默多個(gè)寄主免疫基因，增強(qiáng)病原菌毒性[7，27]。小麥柄銹菌也使用這種策略傳輸milR1 到寄主細(xì)胞抑制病程相關(guān)蛋白基因2（PR2），抑制植物免疫[28]。WEIBERG 等[7]研究灰霉病菌（B.cinerea）感染擬南芥和番茄的早期階段，發(fā)現(xiàn)Bc-sRNAs和信號調(diào)控相關(guān)基因被顯著富集，其中跨界轉(zhuǎn)運(yùn)的3個(gè)Bc-sRNAs 靶向結(jié)合 擬南芥Argonaute 1（AGO1），沉默寄主抗性基因，影響擬南芥和番茄的免疫力，進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)，雙突變B.cinerea的dcl1和dcl2 基因，不能合成DCL1和DCL2，造成sRNAs 合成受阻，影響了病原菌的毒性。證明病原菌產(chǎn)生sRNAs 轉(zhuǎn)運(yùn)至寄主，進(jìn)而影響寄主免疫。

4 跨界sRNAs 在植物抗病育種中的應(yīng)用

跨界sRNAs 發(fā)生在植物與多種病原微生物互作過程中，包括真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等，針對病原真菌，利用HIGS 構(gòu)建跨界RNAi 載體，沉默病原菌毒性相關(guān)的靶向基因[29]，從而使寄主獲得對病原菌的抗性，跨界RNAi 作為植物抗病的新“武器”，拓展了對抗病/感病機(jī)制的認(rèn)識，還為抗病生物技術(shù)的發(fā)展帶來了新機(jī)遇，服務(wù)于我國農(nóng)作物病害綠色防控[30]。例如，ZHANG 等[21，31]利用HIGS 技術(shù)培育出了可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因棉花，該棉花通過表達(dá)RNAi結(jié)構(gòu)使大麗輪枝菌形成菌核的VdH1 基因沉默，病原菌喪失產(chǎn)生菌核的能力，毒力下降。田間試驗(yàn)證明，接種病原菌后，轉(zhuǎn)基因棉花有效控制了棉花黃萎病，該研究首次通過田間試驗(yàn)證明HIGS 技術(shù)在植物抗病研究中的潛力。這些研究為利用sRNAs 技術(shù)進(jìn)行農(nóng)作物抗病蟲改良提供了良好的范例。美國加利福尼亞大學(xué)的GOVINDARAJULU 等[32]利用HIGS技術(shù)培育出了抗萵苣盤梗霉（Bremia lactucae）的轉(zhuǎn)基因萵苣，該作物通過表達(dá)RNAi 結(jié)構(gòu)使萵苣盤梗霉中的關(guān)鍵基因發(fā)生沉默，這些基因的沉默抑制了病原菌的擴(kuò)散，從而起到了控制霜霉病的作用，CHEN 等[33]利用HIGS 技術(shù)構(gòu)建靶向鐮刀菌FcGls1基因的RNAi 載體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌絲細(xì)胞壁缺陷，轉(zhuǎn)基因小麥對赤霉病表現(xiàn)出有效抗性。最新的研究發(fā)現(xiàn)，SKOMINSKA-DURDASIAK 等[34]基于文獻(xiàn)研究和國際小麥基因組數(shù)據(jù)聯(lián)盟的數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，標(biāo)記小麥參與跨界RNAi的14個(gè)基因，并通過重組自交系‘Apache×Biscay’證明（Rab5-like GTPase）基因、Ara6和Dicer1 基因與小麥赤霉病抗性有關(guān)。這為利用跨界RNAi 服務(wù)小麥育種提供了參考信息。ZHU 等[35]在小麥銹?。≒uccinia striiformis）的研究中，發(fā)現(xiàn)PsFUZ7 是調(diào)控Puccinia striiformis 感染和發(fā)育的重要致病因子，針對PsFUZ7 基因，構(gòu)建含有RNAi 結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因小麥品系，其對Puccinia striiformis 具有很強(qiáng)的抗性。該研究證實(shí)了基于RNAi的生物技術(shù)可以有效保護(hù)農(nóng)作物。

5 展望

近年來，我國提出農(nóng)藥減施增效，發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的總體戰(zhàn)略，跨界sRNAs的發(fā)現(xiàn)為發(fā)展環(huán)境友好型的植物保護(hù)舉措提供了新的思路，是當(dāng)前進(jìn)行農(nóng)作物抗病育種的新策略[30]?？缃鐂RNAs 進(jìn)一步揭示了sRNAs 在植物免疫和病原菌毒力形成機(jī)制，明確了跨界sRNAs 是一把雙刃劍，如何利用跨界sRNAs 抑制病原菌毒性基因的表達(dá)，如何利用跨界sRNAs 提高植物的免疫能力是當(dāng)前急需解決的科學(xué)問題。隨著深度測序技術(shù)的發(fā)展，建議利用新一代測序技術(shù)深入挖掘參與植物病原菌互作的sRNAs，充分了解sRNAs的調(diào)控作用。進(jìn)一步鑒定來自病原菌的sRNAs和他們的目標(biāo)基因，揭示病原菌的致病機(jī)制。還要進(jìn)一步鑒定病原菌感染宿主過程中，sRNAs 合成路徑的關(guān)鍵酶，揭示是否可以通過控制病原菌合成sRNAs 路徑中的酶，進(jìn)而控制病原菌的毒力。另外，在對sRNAs 功能鑒定的基礎(chǔ)上，應(yīng)該著重考慮如何將其應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際。爭取將跨界RNAi 技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物病害防控領(lǐng)域，為發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)提供有力工具。