史志丹，宋培玲，郝麗芬，皇甫海燕，燕孟嬌，楊永青，郭 晨，賈曉清，皇甫九茹，李子欽，張寶輝，陳斐斐

（1.內蒙古大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010021；2.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；3.呼倫貝爾農墾集團特泥河農牧場，內蒙古 特泥河 021024）

病原菌侵染寄主植物從可侵染部位的接觸開始，到在寄主體內定殖、擴展、進而使寄主表現(xiàn)病癥，在這個過程中植物個體也會產生相應的抗病或感病反應，并且在生理、組織和形態(tài)上產生一系列的變化。一種寄生物能否成為某種植物的病原菌，取決于病原菌能否克服寄主的抗病機制，如能克服，則病原菌有致病性，寄主植物表現(xiàn)感病，兩者之間具有親和互作關系。如不能克服，病原菌沒有致病性，寄主植物表現(xiàn)抗病，兩者之間具有非親和性互作關系。寄主植物與病原菌之間具有非常復雜的相互作用，涉及植物與病原菌之間的識別、信號傳導及植物防衛(wèi)反應激活等事件[1]。因此，研究植物與病原菌的識別方式、親和性或非親和性的互作模式，對揭示植物與病原菌的互作機制具有重要意義[2]。借助分子標記方法，可以示蹤病原菌在寄主中的入侵、定殖和繁殖過程。標記病原微生物的方法主要有抗生素抗性基因、lacZ 基因、lux 基因、inaZ 基因、xylE 基因、gus 基因以及gfp 基因[3]。目前，在病原菌與寄主互作的研究中，利用綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）標記病原菌，對其侵染過程進行示蹤是最為有效的細胞學方法之一[4]。GFP 作為重要報告基因，具有高靈敏度、穩(wěn)定性好、低細胞毒害性等特點。1962年，SHIMOMURA 等[5]首次在維多利亞多管發(fā)光水母中發(fā)現(xiàn)GFP，直到1992年PRASHER 等[6]克隆出GFP的cDNA 全長后，緊接著在1994年CHALFIE 等[7]在原核大腸桿菌和真核秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中成功表達了具有熒光性的GFP，同時也證明了GFP 在水母中特異組分不存在的條件下熒光也可以正常表達。同年，HEIM 等[8]提出GFP 生色團的發(fā)光機制，并表明了生色團的形成不需要任何酶或輔助因子的參與。此后，GFP 成為一個研究熱點，在多個學科領域引起了廣泛的關注，同時，GFP 作為一種新的報告分子或定位標記物在多種細菌、真菌、植物和哺乳動物細胞中得到廣泛應用，且修飾后GFP 也作為生物探針被應用到試驗中。

1 綠色熒光蛋白基因的病原菌轉化方法

1973年，MISHRA和TATUM對粗糙鏈孢霉進行遺傳轉化，成功獲得轉化子后，關于絲狀真菌遺傳轉化方法的研究迅速發(fā)展起來。用于遺傳轉化方法有很多，針對原生質體的遺傳轉化方法有CaCl2-PEG 介導轉化法，制備真菌原生質體作為感受態(tài)細胞，在含有一定濃度的質粒CaCl2-PEG 緩沖液中，利用電荷間的相互作用力在原生質體表面與外源DNA 形成復合物，原生質體通過內吞作用將復合物整合在受體基因組中[9]。電擊轉化法是受體細胞在瞬間高電壓處理下，形成可恢復的局部電穿孔，使質粒DNA 進入受體細胞，在一定時間內恢復正常生理狀態(tài)從而獲得遺傳轉化子[10]。限制性內切酶介導轉化法（Restriction enzyme mediated integration，REMI）是將限制性內切酶與已經線性化的質粒在PEG的作用下導入受體細胞中，染色體DNA 被限制性內切酶切開與線性質粒連接，從而獲得轉化子[11]。針對完整細胞的遺傳轉化有基因槍轉化法，該方法利用高速微彈發(fā)射裝置，將外源DNA 包被在微小的金?；蜴u粒表面射入受體細胞中，使外源DNA表達[12]。醋酸鋰轉化法，是利用高濃度Li+或其他一價金屬陽離子（Na+、K+、Rb+等）誘導并增強細胞滲透性，使其成為感受態(tài)，在PEG 協(xié)助下完成外源DNA的轉化[13]。農桿菌介導的遺傳轉化法（ATMT），主要是通過農桿菌Ti 質粒上的T-DNA 區(qū)和vir 區(qū)共同完成。T-DNA區(qū)是能夠進行轉移并整合進宿主基因的區(qū)域，vir 區(qū)參與T-DNA的加工、轉移以及整合，小分子酚類和糖類物質誘導激發(fā)會促使vir 區(qū)基因表達，農桿菌侵染將T-DNA 轉移并整合至真菌基因組中[14]，使目的基因表達。不同的轉化方法在植物和病原菌中皆有應用。陳孝仁等[15]利用CaCl2-PEG 介導轉化法用GFP首次標記了大豆疫霉，觀察了大豆疫霉在大豆上的侵染動態(tài)并利用此報告系統(tǒng)顯微觀察了在抗病和感病大豆品種根部大豆疫霉游動孢子的侵染情況，從細胞水平上了解了大豆的抗疫病機制。宿景霞[16]采用電擊轉化方法，將含有綠色熒光蛋白基因的質粒轉入溶磷細菌菌株中觀察其在葡萄根際的存活特征和定殖動態(tài)規(guī)律。張鑫等[17]利用REMI 轉化方法構建葡萄潰瘍病菌（Lasiodiplodia theobromae）轉化子庫?；驑尫ê痛姿徜嚪ㄔ谡婢系膱蟮垒^少[18]。GU 等[19]利用基因槍法研究植物病原真菌分泌蛋白Ps87。醋酸鋰轉化法首次在釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）的轉化中獲得成功，隨后在鬼傘菌（Coprinus lagopus）和粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）等真菌的遺傳轉化中也獲得成功[20]。趙鳳軒[21]通過農桿菌介導法將構建的真菌表達載體pCH-sGFP 導入到大麗輪枝菌中，研究了轉化子在不同抗病類型棉種中侵染過程的差異，此方法在真菌研究中得到了廣泛的應用，根據(jù)轉化對象的不同使用不同的轉化方法，其轉化效率也不相同。

2 綠色熒光蛋白在病原菌侵染過程中的應用

綠色熒光蛋白具有多種優(yōu)點使其在研究病原菌侵染過程中廣泛應用。GFP對受體細胞低毒害性，不會影響受體細胞的正常生長和功能，在紫外光或藍光的照射激發(fā)下便可觀察到綠色熒光，熒光穩(wěn)定有較強的耐受性，可以方便、快捷地進行動態(tài)監(jiān)測[22]。熒光蛋白標記病原菌后，篩選出熒光蛋白穩(wěn)定表達和致病力無明顯差異的轉化子可以接種于不同生育期和不同組織的寄主植物，在不同時間點、不同的組織部位取樣通過熒光或共聚焦顯微鏡直觀地觀察侵染部位的病原菌。自1996年SPELLIG 等成功轉化了玉米黑粉菌，隨后GFP 被應用在多個種屬的真菌中。SEXTON 等[23]將gfp 基因導入黑脛?。↙eptosphaeria maculans）中，觀察其侵染油菜的過程。陶愷[24]通過綠色熒光蛋白標記菌株的獲得，揭示了大豆疫霉與寄主親和、非親和互作的動態(tài)變化過程。賈娜娜[22]利用ATMT 技術對梨腐爛病菌進行綠色熒光蛋白標記，獲得了梨腐爛病菌轉化子，并用篩選到的強、弱致病力菌株轉化子侵染梨樹組織觀察病原菌在梨樹中的侵染過程。對獲得的病原菌轉化子利用分子技術擴增獲得gfp 基因的兩翼序列，分析突變的目的基因及其功能，從而為研究病原菌的致病機理提供基礎[25]。張鍵[26]構建了大麗輪枝菌的T-DNA 突變體庫，分析并研究了T-DNA 插入位點的側翼序列以及突變基因的功能，發(fā)現(xiàn)敲除VdOCH1 基因能夠降低病原菌的致病性。姚錦愛等[27]采用農桿菌介導法成功將綠色熒光蛋白轉入到建蘭莖腐病原尖孢鐮刀菌F02 中，并獲得了表達GFP的轉化子。孫洪寶等[28]利用綠色熒光蛋白作為標記，明確了枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖動態(tài)，從組織學的角度闡釋西瓜與枯萎病菌親和互作和非親和互作的差異。

3 綠色熒光蛋白在定量檢測植物組織中病原物數(shù)量的應用

真菌與植物相互作用的研究中，通過研究受感染的宿主植物組織中病原菌生物量對于明確病害的進展具有重要意義。目前的研究方法存在一定的局限性。對真菌生物量的定量常通過幾丁質和麥角甾醇的含量來檢測。前者是細胞壁的組成成分，后者是真菌細胞膜的重要組成成分。但是，這兩種物質存在于多種真菌中，因此這種測定方法不具有物種特異性。病原菌生物量的定量也可以通過測定特定蛋白質（DNA 或RNA）的量，但是，這兩種方法比較耗時，且提取出的RNA 容易降解。而綠色熒光蛋白作為一種高效標記物有一個優(yōu)點是其熒光強度和gfp的表達量成正比，MAOR 等[29]指出綠色熒光強度與異源金線菌轉化株的菌絲數(shù)量高度相關，因此可以通過測定熒光強度而定量真菌的生物量。CHEN 等[30]利用改良的GFP標記大豆炭疽（Colletotrichum destructivum）和西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare），測定其接種葉片中綠色熒光蛋白的積累量，同時與Northern blot 雜交技術測定真菌肌動蛋白基因表達量做對比，結果表明，熒光量與真菌生長密切相關，利用GFP標記的真菌檢測綠色熒光強度是一種準確、快速和簡便的方法，可以定量寄主植物細胞內真菌的生長[31]。

4 綠色熒光蛋白在病原菌亞細胞結構定位中的應用

GFP作為一個分子標記可以在細胞的任何區(qū)域進行定位，因此，GFP 在真菌亞細胞的研究和蛋白功能研究中廣泛運用。構建GFP 融合蛋白是亞細胞定位中的一種重要手段，亞細胞定位能明確表達蛋白產物在細胞中出現(xiàn)的部位，將GFP與細胞器相關蛋白融合表達，就可以觀察候選蛋白在細胞核、細胞質或細胞膜的分布，以及在不同階段的轉運情況，這對于研究真菌的有絲分裂、蛋白分泌、菌絲融合等過程具有重要作用[32]。RIEDEL 等[33]通過GFP標記的橡樹疫霉菌（Phytophthora ramorum），研究其各個生活史階段營養(yǎng)體的細胞學形態(tài)，與未標記菌株相比，GFP菌株致病能力明顯變化。AUDREY 等[34]通過將青色熒光蛋白（CFP）、綠色熒光蛋白（GFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、紅色熒光蛋白（mCherry）與已知亞細胞定位的基因的N 端或C 端相連，構建融合表達載體，對致病疫霉（Phytophthora infestans）體內的內質網、高爾基體、線粒體、細胞核以及過氧化物酶體等細胞器形態(tài)和分布進行了研究。郭曉宇等[35]利用熒光蛋白標記結合熒光染色的方法來研究稻瘟病菌有性世代的細胞結構，清晰地標記了子囊和子囊孢子的結構、細胞器和存儲物質。

5 展望

綠色熒光蛋白廣泛應用于植物病害的各個方面，從植物病原菌的檢測、侵染定殖、抗病基因的表達、抗病轉基因植株的篩選及病原菌致病機理的研究到分子生物學和生態(tài)學等方面的應用，GFP 都具有其他報告基因不可替代的優(yōu)點。尤其是在研究病原菌與植物互作方面，能夠實時明確病原菌的侵染過程。以上僅是GFP 眾多應用中的一小部分，隨著GFP 工程的發(fā)展，GFP的應用將會更加廣闊。