王洋洋 隋鶴鳴，2 趙善江 許慧韜 郝海生 龐云渭 趙學(xué)明朱化彬

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062）

家畜胚胎移植技術(shù)（Embryo transfer，ET），尤其是牛胚胎移植技術(shù)經(jīng)過(guò)幾十年的研究日趨成熟，并在生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用，成為家畜育種和快速擴(kuò)繁的重要技術(shù)手段［1-4］。

目前，供體母牛超數(shù)排卵（簡(jiǎn)稱超排）后第7天非手術(shù)采集獲得的胚胎仍然是移植所需胚胎的重要來(lái)源［5］。雖然眾多研究人員曾對(duì)牛超排方法及其影響因素展開(kāi)深入研究，并取得了較大進(jìn)展［6-7］，但是牛胚胎移植成功近70年來(lái)，供體牛每次超排獲得的平均可用胚胎數(shù)幾乎沒(méi)有增加［8］，而且約有1/3的供體母牛對(duì)超排反應(yīng)較差［9-10］，約64%的供體牛生產(chǎn)的可移植胚胎數(shù)低于平均值［11］，甚至有15%左右的供體牛不能提供可移植胚胎［12-13］。超排反應(yīng)的不確定性增加了牛體內(nèi)胚胎的生產(chǎn)成本，限制了牛胚胎移植技術(shù)在生產(chǎn)中進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用［14-16］。

因此，近年來(lái)為了提高超排效果，降低牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)成本，許多研究者開(kāi)展了牛超排處理程序與影響因素的研究，并取得了較好的進(jìn)展。本文簡(jiǎn)介了牛超排方法與主要影響因素，重點(diǎn)綜述了牛超排最新研究進(jìn)展，以期為牛超排效果的改善和胚胎移植效率的提高提供參考。

1 牛超數(shù)排卵及其影響因素

1.1 牛超數(shù)排卵

超數(shù)排卵是在母牛發(fā)情周期的一定時(shí)間給予外源促性腺激素如促卵泡素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）處理，從而使供體母牛卵巢上有多枚卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵，在人工授精后一定時(shí)間內(nèi)通過(guò)非手術(shù)采集而獲得多枚胚胎的技術(shù)［17-19］。雖然初情期后母牛卵巢上腔前卵泡的生長(zhǎng)不需要促性腺激素的支持，在卵巢旁分泌和自分泌作用的調(diào)控下即可由靜止原始卵泡庫(kù)自發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)卵泡庫(kù)，但是當(dāng)卵泡發(fā)育至有腔卵泡階段及其隨后的發(fā)育進(jìn)程則依賴于血液中足夠的促性腺激素（FSH和LH）的支持［20-23］，缺少FSH的支持，卵泡就無(wú)法繼續(xù)發(fā)育而發(fā)生閉鎖退化。因此，如果在適宜的發(fā)情狀態(tài)下對(duì)母牛注射外源FSH，以彌補(bǔ)牛外周血中因FSH濃度下降導(dǎo)致的內(nèi)源性FSH不足，就可使母牛卵巢上多枚有腔卵泡都能得到充分的FSH的支持，從而得以繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育、形成優(yōu)勢(shì)卵泡并排卵［24］，從而起到超數(shù)排卵的作用。

牛超數(shù)排卵成功的前提是：（1）外源FSH可支持供體牛卵巢上多枚卵泡發(fā)育、成熟并排卵；（2）外源FSH處理不影響卵母細(xì)胞質(zhì)量以及發(fā)育和受精能力；（3）外源FSH處理不降低供體牛生殖道的機(jī)能，特別是輸卵管支持卵母細(xì)胞受精、早期胚胎發(fā)育和運(yùn)行胚胎的能力。

超排期間供體牛血液中FSH必須維持一定的濃度才能保證超排效果。因此，利用外源FSH超排處理供體牛時(shí)，根據(jù)其半衰期長(zhǎng)短而采取不同的給藥方式是維持供體牛血液中外源FSH濃度的保障。馬絨毛膜促性腺激素（Equine chorionic gonadotrophin，eCG），過(guò)去亦稱孕馬血清促性腺激素（Pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG），是最早用于牛超數(shù)排卵的促性腺激素之一。20世紀(jì)中期許多研究者，特別是美國(guó)的哈弗士和艾弗里等詳細(xì)地研究了eCG處理對(duì)供體牛發(fā)育卵泡數(shù)量、卵泡排卵和卵母細(xì)胞受精、胚胎質(zhì)量的影響，建立了eCG超排供體牛的基本方法，并取得了較好的超排效果［19，25-27］。由于eCG半衰期較長(zhǎng)，因而用eCG對(duì)供體牛超排時(shí)只需要一次注射就能起到超排的作用［28］，但是用eCG超排的方案存在如下問(wèn)題：一是由于eCG同時(shí)具有FSH和LH的活性，導(dǎo)致供體牛對(duì)eCG超排處理的反應(yīng)差異大，效果不穩(wěn)定；二是由于eCG半衰期長(zhǎng)（40 h左右），在注射后的較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可對(duì)卵巢造成持續(xù)性刺激，從而容易造成大卵泡不排卵或未排卵卵泡黃體化；三是造成供體牛生殖內(nèi)分泌紊亂，雌激素分泌過(guò)多，形成不利于早期胚胎發(fā)育的生殖道內(nèi)環(huán)境；四是長(zhǎng)時(shí)間的促性腺激素刺激可促使卵母細(xì)胞提前成熟，從而影響卵母細(xì)胞受精或受精卵發(fā)育［29］。

相比之下，F(xiàn)SH對(duì)牛的作用效果更加溫和，F(xiàn)SH也成為超排時(shí)使用最為普遍的促性腺激素。由于FSH含糖量較低，其在供體牛體內(nèi)的半衰期只有5 h左右［30］。因此，超排時(shí)需要每天2次連續(xù)4 d注射FSH，才能保證供體牛血液中維持超排所需的FSH濃度，研究表明此方案可獲得較好的超排效果［10，31-33］。目前，全世界廣泛使用的FSH超排供體牛的方法是連續(xù)4 d每天2次遞減注射FSH法［27］，可分為兩種基本的處理程序：方法1，在供體牛自然發(fā)情或前列腺素（Prostaglandin，PG）同期處理發(fā)情后一定時(shí)間內(nèi)（發(fā)情后8-13 d）任意一天開(kāi)始注射FSH，上下午各注射1次，連續(xù)注射4 d，第3天上下午注射FSH同時(shí)注射PG，第5天上午（早晨）觀察供體牛發(fā)情，第5天晚上人工授精（Artificial insemination，AI）配種，間隔12 h第2次配種，第12天上午采集胚胎；方法2是在供體牛發(fā)情周期的任意一天埋植孕酮制劑（Controlledinternaldrug release，CIDR），埋植后第5-7天的任意一天開(kāi)始上午、下午各注射1次FSH并在第7天撤栓，其余處理與方法1相同。

1.2 影響牛超數(shù)排卵效果的因素

雖然影響牛超排效果的因素眾多而復(fù)雜，但可分為供體牛自身因素和外部因素。供體牛自身因素主要包括超排時(shí)牛年齡與胎次、生產(chǎn)性能、發(fā)情狀態(tài)和卵巢機(jī)能［34-36］、體況和疾病等［37-38］；外部因素主要包括供體牛飼料營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng)方式［39-41］、激素種類與來(lái)源和注射方法與劑量［42-43］、溫度與季節(jié)、超排處理程序、采卵方法和沖卵操作人員技術(shù)水平等［44-47］。

雖然許多研究人員試圖尋找供體牛對(duì)外源FSH超排處理反應(yīng)差異的分子基礎(chǔ)，但是超排效果與供體牛遺傳基礎(chǔ)（基因型）的相關(guān)性較低，重復(fù)力也較低［48-49］，因此，目前試圖通過(guò)遺傳因素選擇超排效果好的供體牛還存在巨大困難。

2 超數(shù)排卵研究最新進(jìn)展

連續(xù)4 d共8次注射外源FSH超排供體牛的方法可取得較好的超排效果，但是這種超排處理程序也存在下列問(wèn)題：（1）工作量大；（2）供體牛應(yīng)激大，影響超排效果；（3）供體牛需要相對(duì)集中飼養(yǎng)。因此，簡(jiǎn)化超排處理程序?qū)μ岣吖w牛超排效果和降低胚胎生產(chǎn)成本具有重要的實(shí)際意義［50］。近20年來(lái)，為提高牛的超排效率，許多研究者針對(duì)牛超排方案的改進(jìn)進(jìn)行研究，并取得了一定進(jìn)展［51-52］。

2.1 FSH一次注射法

雖然很早就有研究者試圖對(duì)牛進(jìn)行FSH一次注射以簡(jiǎn)化超排程序，但是取得的效果并不理想［53］。后來(lái)有研究者將FSH皮下一次性注射到體況良好的肉牛供體獲得了較好的超排效果［54］，但是皮下一次注射FSH方法對(duì)體況較差的肉牛和荷斯坦牛的超排效果較差［50，53，55］，改為肌肉一次注射也不能達(dá)到預(yù)期的超排效果［50］，這可能是因?yàn)轶w況較差肉牛和荷斯坦供體牛注射部位脂肪組織較少，皮下一次性注射可能將FSH注射到肌肉中，不能有效保證FSH被緩慢吸收進(jìn)入血液，從而影響超排效果。如果選擇短針頭（～12 mm）或者皮下脂肪較多部位（如肩部）注射FSH，即可避免將FSH注射到肌肉中，并且可取得較好的超排效果［50，55］。

有試驗(yàn)研究了兩次注射FSH超排荷斯坦供體牛的方法，即第一天注射總劑量75%的FSH，48 h后注射剩余25%劑量的FSH，超排效果優(yōu)于一次注射FSH，但是不如4 d共8次FSH注射法［55］。

如果將FSH溶解在某些物質(zhì)溶液——緩釋劑中，在注射供體牛后FSH可緩慢釋放，就可以在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)使供體牛血液中FSH維持在一定的濃度，從而達(dá)到超排的作用。作為FSH的緩釋劑必須具備以下特性：（1）機(jī)體內(nèi)可降解；（2）在機(jī)體組織不發(fā)生反應(yīng)；（3）使用方便。目前，牛超排常用的FSH緩釋劑包括氫氧化鋁凝膠溶液（Al-gel）、透明質(zhì)酸溶液（Hyaluronan，HA）和聚乙烯吡咯烷酮溶液（Polyvinylpyrrolidone，PVP）等。

研究表明，將一定劑量的FSH溶解在30%的PVP溶液中超排日本黑牛、荷斯坦奶牛和泰國(guó)本地牛，都取得了與4 d共8次注射FSH超排方法相似的效果［56-58］。

Kimura等［59］研究了氫氧化鋁凝膠（Al-gel）作為FSH緩釋劑對(duì)供體牛進(jìn)行一次注射的超排方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，30 mg FSH溶解在Al-gel中一次注射超排日本黑牛，與對(duì)照組4 d共8次注射超排供體牛的效果類似，表明氫氧化鋁凝膠可作為FSH佐劑超排供體牛。Al-gel是許多疫苗的佐劑［60-61］，多應(yīng)用于注射類藥物中。但肌肉注射Al-gel易引起注射部位的組織硬化，限制了其在牛超排工作中的應(yīng)用。

目前使用較多的FSH緩釋劑是透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸是一類生物大分子聚合物，含有2000-2500個(gè)重復(fù)單位的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺雙糖多聚合物，廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)如家畜生殖道中，其在動(dòng)物組織內(nèi)可生物降解，不參加生物反應(yīng)［62］，HA分子在水溶液中呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其水溶液具有一定的黏度，是FSH和其它藥物的良好佐劑［63-64］。

有試驗(yàn)以透明質(zhì)酸溶液溶解的FSH對(duì)供體牛進(jìn)行超排處理。結(jié)果表明，用2%的透明質(zhì)酸溶液溶解的FSH對(duì)牛進(jìn)行一次性肌肉注射處理所得胚胎總數(shù)和可用胚胎數(shù)與4 d共8次注射超排方法相似。用1%的透明質(zhì)酸溶液溶解的FSH對(duì)牛進(jìn)行皮下一次性注射處理，發(fā)現(xiàn)FSH吸收較快，外周血液中不能持續(xù)維持超排需要的FSH濃度，從而使很多卵泡不能發(fā)育到排卵階段，僅在處理開(kāi)始時(shí)發(fā)育狀態(tài)良好，在后期便閉鎖退化［65-67］。Tribulo等［68］研究了以西門塔爾牛、婆羅格斯牛和安格斯雜交牛為供體牛，用1%的HA溶解的FSH對(duì)其進(jìn)行間隔48 h兩次注射的超排方案，即第一次注射總劑量的67%，48 h后注射其余的33%。結(jié)果表明該法獲得了與常規(guī)超排方法相一致的結(jié)果［69-70］。而Palomino等［71］將FSH溶解在0.5%的HA溶液中分3次間隔36 h注射超排美洲森林野牛也取得了較好的超排效果。

雖然2%的HA溶解的FSH超排效果較好，但是FSH較難溶解在2%的HA中，這給超排時(shí)現(xiàn)場(chǎng)溶解FSH的操作帶來(lái)不便。相比之下，F(xiàn)SH更容易溶解在1%或0.5%的HA中。以1%或0.5%的HA溶解的FSH，兩次注射（間隔48 h）或者3次注射（間隔36 h）對(duì)牛超排處理，既減少了FSH的注射次數(shù)，又保證了供體牛的超排效果，是較理想的FSH緩釋超排方案［72］。另外，不同濃度HA緩釋的FSH 1次注射超排肉牛能取得較好的結(jié)果，但是同樣方法對(duì)泌乳荷斯坦牛的超排效果并不理想。這可能是因?yàn)槊谌槟概４x旺盛，血液流經(jīng)肝臟的速度快，因而FSH代謝也較快［72］，需要適當(dāng)增加FSH的注射次數(shù)才可能保證超排效果，但還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 重組長(zhǎng)效FSH

由于垂體提取的天然FSH分子中所含糖基鏈較短，因而FSH在體內(nèi)的半衰期較短。通過(guò)基因重組技術(shù)，設(shè)計(jì)改造FSH結(jié)構(gòu)，增加FSH分子的糖基長(zhǎng)度以生產(chǎn)長(zhǎng)效重組FSH（rFSH），延長(zhǎng)其在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)半衰期，則在家畜繁殖和人類輔助生殖中具有廣闊的應(yīng)用前景［73-75］。與用常規(guī)FSH的超排方案相比，用長(zhǎng)效重組FSH制劑超排供體牛時(shí)可減少注射次數(shù)，節(jié)省人力和減少供體牛應(yīng)激，因而很早就有人利用重組牛源FSH（rbFSH）對(duì)牛進(jìn)行超排處理，并獲得較好的超排效果。Carvalho等［76］研究了重組FSH超排12-15月齡的荷斯坦供體牛，結(jié)果表明，一次性注射長(zhǎng)效rbFSH對(duì)供體牛超排的效果與4 d共8次注射FSH的超排結(jié)果相似，且高劑量注射rbFSH的牛超排效果更好，但不同類型的rbFSH制劑的超排效果差別很大［73］。因此，體外重組長(zhǎng)效FSH在應(yīng)用前，還需要深入研究：（1）不同類型重組FSH的超排方案；（2）重組FSH的適宜注射劑量；（3）重組FSH在母牛體內(nèi)的代謝規(guī)律。

2.3 供體牛選擇

2.3.1 AMH與供體選擇 超排前能夠選擇超排效果好的供體牛，則可有效提高胚胎生產(chǎn)效率和降低胚胎生產(chǎn)成本。雖然目前還未發(fā)現(xiàn)供體牛對(duì)外源FSH反應(yīng)差異的有效遺傳標(biāo)記，但有些激素如抗繆勒管激素（Anti-müllerian hormone，AMH）與供牛超排效果具有一定的相關(guān)性。AMH是由雄性動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞和雌性動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞分泌的糖蛋白質(zhì)激素，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族［77-78］。初情期后母畜卵巢中發(fā)育的原始卵泡和早期有腔卵泡顆粒細(xì)胞分泌AMH，而閉鎖卵泡和優(yōu)勢(shì)卵泡AMH含量則很低。因此，外周血中AMH的濃度，反映了家畜卵巢活性、發(fā)育卵泡數(shù)量和卵泡質(zhì)量等狀況［79-82］，可作為母牛有腔卵泡庫(kù)、繁殖性能和胚胎生產(chǎn)的內(nèi)分泌標(biāo)記［83-86］。

AMH可作為選擇荷斯坦供體牛的生物標(biāo)記。Rico等詳細(xì)研究了母牛血液中AMH濃度與超排效果之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，AMH濃度與超排時(shí)供體牛卵巢直徑3-7 mm大小的卵泡數(shù)量呈正相關(guān)，而這些卵泡正是超排時(shí)對(duì)外源FSH敏感、能夠發(fā)育成熟并排卵的卵泡，隨后他們還發(fā)現(xiàn)經(jīng)FSH處理的牛在發(fā)情時(shí)，其血液中AMH濃度低的供體牛卵巢上大卵泡數(shù)量就少；并且采集胚胎時(shí)血液中AMH濃度低的供體牛，采集獲得的胚胎和受精卵也很少［87-88］。Verstegen等［81］也發(fā)現(xiàn)，母牛在2月齡左右時(shí)其外周血AMH濃度達(dá)峰值，此后隨著牛的老化才開(kāi)始下降，AMH濃度平均可保持4月左右的穩(wěn)定值，外周血AMH濃度高的牛超排獲得的胚胎數(shù)更多。Souza等［88］發(fā)現(xiàn)供體牛在發(fā)情周期的不同時(shí)間點(diǎn)其血液中AHM含量相差不大，隨著AMH濃度的升高，供體牛黃體數(shù)、獲得卵數(shù)/胚胎和可用胚胎數(shù)均增加。高濃度AMH組的供體牛黃體數(shù)和獲得胚胎總數(shù)是低濃度AMH組牛的2倍，但AMH與卵母細(xì)胞的受精率沒(méi)有相關(guān)性。Monniaux等［85］研究也發(fā)現(xiàn)，供體母牛血液AMH濃度高的供體母牛頭均獲得胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)高于AMH濃度低的供體牛。畢江華等［89］分析了重復(fù)超排的荷斯坦供體牛血液中AMH濃度與超排效果之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胚胎采集時(shí)，血液AMH濃度高的供體牛其超排效果優(yōu)于AMH濃度低的牛。但該研究試驗(yàn)牛只數(shù)量較少，時(shí)間跨度較大，具體效果仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

AMH也可作為選擇肉牛供體的生物標(biāo)記。Hirayama等［90］詳細(xì)研究了不同月齡的日本黑牛血液中AMH的變化及其與牛超排效果的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青年牛10或11月齡前后血液AMH濃度與13-18月齡時(shí)的超排效果呈正相關(guān)，因此認(rèn)為11月齡青年牛血液中AMH可作為供體牛早期選擇的生物標(biāo)記，但是經(jīng)3次超排后的供體牛血液中AMH濃度顯著降低，其與超排效果的相關(guān)性也降低［90］。Nabenishi等［91］研究也發(fā)現(xiàn)，日本黑牛供體血液中AMH濃度相對(duì)穩(wěn)定，在人工授精時(shí)AMH濃度高的牛超排所得胚胎總數(shù)、可移植胚胎數(shù)皆更多。

2.3.2 重復(fù)超排與供體選擇 雖然超排效果與供體牛的遺傳相關(guān)性不大，但是超排反應(yīng)良好的供體牛，再次超排時(shí)效果往往也較好，因而也可以作為供體選擇的依據(jù)［48］。Ireland等［92］研究表明，超排時(shí)卵巢上發(fā)育卵泡數(shù)量多的供體母牛超排效果好于卵泡數(shù)少的供體，并具有很高的重復(fù)性。

2.4 吸除優(yōu)勢(shì)卵泡

雖然超排時(shí)供體牛卵巢上眾多的有腔卵泡是超排效果的保證［90，92］，然而因優(yōu)勢(shì)大卵泡可抑制早期有腔卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)直徑6 mm以下卵泡的閉鎖［93］，所以超排處理開(kāi)始時(shí)，如果母牛卵巢上存在優(yōu)勢(shì)卵泡會(huì)降低供體牛的超排效果［92，94］。因此，超排時(shí)通過(guò)超聲波檢查卵巢上優(yōu)勢(shì)卵泡的存在并吸除優(yōu)勢(shì)卵泡，就可解除優(yōu)勢(shì)卵泡對(duì)其他有腔卵泡發(fā)育的抑制作用，并開(kāi)始新的卵泡發(fā)育波，從而可提高超排效果［95-97］。

但是，吸除優(yōu)勢(shì)卵泡需要特殊設(shè)備——B超儀和吸卵設(shè)備，以及操作熟練的技術(shù)人員，因而在實(shí)際生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的廣泛應(yīng)用存在一定的困難。

3 趨勢(shì)與發(fā)展

供體牛超數(shù)排卵效果不穩(wěn)定性和不可有效預(yù)測(cè)性仍然是影響牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)的重要因素，因此，未來(lái)仍然需要在以下幾個(gè)方面繼續(xù)研究和完善：（1）建立選擇供體牛的有效方法。目前AMH可作為供體母牛選擇的生物標(biāo)記，但是還需要建立快速定量測(cè)定AMH的有效方法，包括統(tǒng)一度量衡單位。同時(shí)，還應(yīng)繼續(xù)尋找可預(yù)測(cè)牛超排效果的遺傳標(biāo)記和生物標(biāo)記；（2）優(yōu)化超排程序。雖然傳統(tǒng)的4 d共8次注射FSH方法的超排效果較穩(wěn)定，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率也并未提高。研究建立利用重組FSH超排供體牛的方法并降低其成本可能是優(yōu)化供體牛超排方法的有效途徑；（3）解析營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境因素對(duì)牛超排效果的影響及其機(jī)制。營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境（包括疾?。?duì)供體牛繁殖機(jī)能的影響是不言而喻的，但是營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境對(duì)超排牛卵泡發(fā)育與排卵、胚胎發(fā)育與質(zhì)量等的具體影響及其機(jī)制還有待深入研究。