張小慧 黃悅悅 王世凱 譚衛(wèi)紅 毛獻寶 李政達 周亭亭 韋娉嬪 劉慶友 薛林濤

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學與遺傳中心，南寧市 530021，電子郵箱：zhangxhscu@163.com)

卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是通過顯微操作手段將精子直接注射入卵子胞漿內，從而輔助其完成受精的治療手段，其在臨床上的成功應用有效地解決了因男方精子質量差、精卵結合障礙、無精子癥等因素導致的不育問題。目前由于男方病因不同，ICSI治療周期中用于顯微注射的精子來源有所差異，而不同來源精子對ICSI治療的正常受精率、胚胎發(fā)育參數(shù)及臨床妊娠結局的影響，仍然存在爭議[1-2]，且其機制仍不清楚。近年來有研究顯示，精子功能參數(shù)異常是輔助生殖治療正常受精率及臨床治療結局的一個重要影響因素[3]；同時不同來源精子由于其所處階段及生理微環(huán)境的差異，精子功能參數(shù)可能存在差異[4]。本研究通過比較使用不同來源精子行ICSI對受精、胚胎發(fā)育及臨床妊娠結局的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2010年1月至2016年11月在本中心接受ICSI技術治療的703對不育夫婦臨床資料。納入病例均滿足ICSI技術治療的臨床指征：(1)嚴重少弱精子癥(精液濃度<5×106/mL或前向運動百分率<10%)；(2)前次體外受精失敗或正常受精率<30%；(3)采卵當日精液經密度梯度離心處理后前向運動精子總數(shù)<1×106條；(4)男方為梗阻性無精子癥。納入標準：(1)女方年齡≤37歲；(2)女方經過體格檢查、病史詢問、婦科B超及內分泌、血液生化檢查，除單純輸卵管因素外，未發(fā)現(xiàn)其他可能影響生育的疾病；(3)夫婦雙方染色體核型分析未見異常。將體外射精采集精子的病例分為正常精液組(A組)56例，少弱精子癥組(B組)364例；將手術從睪丸或附睪取得精子的病例分為附睪精子組(C組)187例，睪丸精子組(D組)96例。

1.2 方法

1.2.1 精液采集：男方禁欲2～7 d，在女方取卵當日上午采用手淫法采集精液，收集于清潔廣口的塑料無菌杯中，用非連續(xù)密度梯度離心法結合上游法[5]行優(yōu)化處理，37℃培養(yǎng)箱孵育備用。梗阻性無精男性于女方取卵當日，采用經皮附睪精子抽吸術或經皮睪丸精子抽吸術[6]采集精液，采用直接離心法[5]1 640 r/min離心5 min進行優(yōu)化處理，去上清后37℃培養(yǎng)箱孵育備用。

1.2.2 精子DNA碎片率檢測：使用精子染色質擴散法[7]檢測優(yōu)化后精子DNA碎片率，按照西班牙Halotech DNA S.L.公司的Halosperm?試劑盒(批號：4078105)說明書進行操作。精子DNA碎片化判定標準：精子頭部產生光暈寬度小于精子核直徑的1/3，或精子頭部無光暈，或精子頭部不著色或核形態(tài)不規(guī)則。精子DNA碎片率=DNA碎片化的精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.2.3 精子頂體完整率：采用異硫氰酸熒光素標記的豌豆凝集素法[5]評估精子頂體功能。使用磷酸鹽緩沖液將優(yōu)化后精液濃度調整至5×106/mL，取10 μL均勻涂抹于干凈載玻片上，自然干燥；將精子涂片置于95%的無水乙醇中固定30 min，自然干燥后置于25 μg/mL的熒光染料中4℃避光染色8～12 h；取出玻片，用去離子水輕微洗滌沖洗10 s后封片；450～490 nm激發(fā)光下使用400倍油鏡觀察精子涂片，至少計數(shù)400個精子。精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻則判定為頂體完整精子，精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光帶或者頂體區(qū)無熒光染色則判定為自發(fā)頂體反應精子。頂體完整率=頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.2.4 ICSI受精：所有女方根據(jù)年齡、激素水平和卵巢儲備功能行促排卵方案，當直徑達18 mm及以上的卵泡數(shù)量≥2枚時，進行扳機，扳機36 h后行卵泡穿刺。取卵4～6 h后挑選形態(tài)好、活力正常的精子對每個成熟卵母細胞行ICSI。取卵后72 h參考卵裂期胚胎評分系統(tǒng)[8]，對卵裂期胚胎進行質量評估標準。卵母細胞受精后第5天、第6天，觀察囊胚形成情況，參照人類囊胚評分系統(tǒng)[9]進行囊胚分級。根據(jù)子宮內膜情況行新鮮胚胎移植。胚胎移植后，第14天檢測尿或血人絨毛膜促性腺激素，第4～5周B超檢測孕囊和胎心，電話隨訪妊娠情況及產科結局。

1.3 觀察指標 比較4組的精子DNA碎片率、精子頂體完整率、正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率、可凍囊胚形成率、優(yōu)質囊胚形成率、移植周期數(shù)、移植胚胎數(shù)、每周期移植胚胎數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產率、活產率和男女嬰性別比。其中正常受精率=2個原核受精卵數(shù)/注射成熟卵母細胞數(shù)×100%；正常卵裂率=2個原核卵裂胚胎數(shù)/2個原核受精卵總數(shù)×100%；優(yōu)質胚胎率=優(yōu)質胚胎數(shù)/2個原核卵裂胚胎數(shù)×100%；囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)總數(shù)×100%；可凍囊胚形成率=可凍囊胚數(shù)/囊胚培養(yǎng)總數(shù)×100%；優(yōu)質囊胚形成率=優(yōu)質囊胚數(shù)/囊胚培養(yǎng)總數(shù)×100%；胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=B超觀察到妊娠的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產率=流產的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；活產率=活產的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；男女嬰性別比=出生男嬰數(shù)/出生女嬰數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，不滿足正態(tài)分布的計量資料以[M(Q1,Q3)]表示，比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 4組患者基本情況及精子參數(shù)比較 B組的男方年齡大于C組與D組，A組與B組的女方年齡均大于C組與D組(均P<0.05)。A組與B組精子DNA碎片率低于C組與D組，而精子頂體完整率高于C組與D組(均P<0.05)。見表1。

表1 不同分組患者基本情況及精子參數(shù)比較(x±s)

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

2.2 4組正常受精率與胚胎質量比較 A組的正常受精率高于B組、C組與D組，且B組的正常受精率高于C組(P<0.05)。B組的優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率和可凍囊胚形成率低于D組(P<0.05)。4組的正常卵裂率、優(yōu)質囊胚形成率差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 不同來源精子正常受精率與胚胎質量對比

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

2.3 4組臨床結局比較 4組每周期移植的胚胎個數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率、流產率和男女嬰性別比差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 4組分臨床結局對比

3 討 論

精子在睪丸中生成時已經具有完整的父源遺傳物質和功能活性的頂體蛋白酶，進入附睪并經頭、體、尾運行后，精子核進一步成熟，同時頂體外膜抗原分布改變，最后精子通過生殖管道獲得受精能力。不同來源的精子，精子核組裝程度和頂體的成熟度不同，因此受精結局有所差異[10]。當精子核DNA損傷時，其進入卵子后精子核染色質解聚受到影響，進而影響受精，而高DNA碎片率與ICSI治療的正常受精率呈負相關[3]。頂體內生物活性蛋白酶促進卵子激活和精子核染色質的解凝縮，從而促進受精[11]。本研究結果顯示，4組的正常受精率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中A組、B組的正常受精率均高于C組，提示不同來源精子用于ICSI治療，正常受精率存在差異；同時，A組、B組的DNA碎片率低于C組，而頂體完整率高于C組(P<0.05)，這提示由于不同來源精子的DNA碎片率和頂體完整率不同，可能導致ICSI的正常受精率存在差異。

胚胎發(fā)育到 4～8 細胞階段時，合子基因組開始激活，父源基因對胚胎發(fā)育的影響開始顯現(xiàn)。盡管有研究結果顯示射出精子和睪丸精子的囊胚形成率和囊胚質量無明顯差異[12-13]，但本研究結果顯示B組的優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率和可凍囊胚率低于D組(P<0.05)。其原因可能有3個方面：首先，未成熟的精子生成后從生精小管向附睪遷移的過程中產生活性氧，引起精子氧化應激損傷，致使精子的結構和功能受損[14]，同時由于環(huán)境、生活習慣、肥胖、感染或者其他疾病等原因，少弱精子癥患者精子的微環(huán)境變差，產生的超氧化物濃度高，精子氧化應激損傷更嚴重[15]，而睪丸中的精子中心粒等受損傷小[16]，使其所形成的胚胎發(fā)育潛能好；其次，本研究中睪丸精子來源于梗阻性無精子癥患者，而大多數(shù)此類患者睪丸的生精功能正常，但少弱精子癥患者多數(shù)生精功能受損，表觀遺傳異常，表觀遺傳通過調節(jié)基因表達和細胞的功能，最終影響胚胎的質量[17]；最后，射出精子的濃度和前向運動率與精子染色體的非整倍性呈負相關[18]，少弱精子癥的染色體精子非整倍性升高[19]，非整倍性的精子導致胚胎染色體異常，少弱精子癥患者的胚胎發(fā)育潛能比正常精液者差。因此，少弱精子癥患者行ICSI治療時所獲胚胎的發(fā)育潛能差，臨床上應予以重視。

本研究結果還顯示，4組的胚胎種植率、臨床妊娠率、流產率、活產率、男女嬰性別比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與趙杰等[20]的研究結果相同。這可能是由于用于ICSI的精子數(shù)量非常有限，故優(yōu)先選擇活力和形態(tài)最好的精子，以減小精子異常對ICSI結局的影響。精子進入胞質后可進一步進行生理選擇，以順利完成受精，并促進受精卵發(fā)育成優(yōu)質胚胎。而臨床胚胎移植時需要經過嚴格的胚胎質量篩選，挑選質量最佳的胚胎移植入宮腔，也從一定程度上淘汰染色體異常的胚胎，并減少精子缺陷對臨床結局的影響。

綜上所述，ICSI周期使用不同來源精子會導致精子DNA碎片率和頂體完整率存在差異，從而影響正常受精率。少弱精子癥來源的精子可影響ICSI治療周期的胚胎發(fā)育結局，因此少弱精子癥患者進行ICSI治療前，有必要進行精子功能檢查評估，加強男科臨床治療，改善精子質量和功能，以提高臨床治療結局。