許勇，李波 ，林強(qiáng) ，鐘昌桃，劉東 ，程愿 ，鐘云昌

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，四川 瀘州 646000；2.自貢市第三人民醫(yī)院 肝膽外科，四川 自貢 643000；3.自貢市第四人民醫(yī)院 肝膽外科，四川 自貢 643000）

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是人類病死率最高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。MicroRNA是一類長度在25個堿基以內(nèi)的單鏈RNA[2]。microRNA-92a（miR-92a）是近年來新鑒定的出的一種microRNA，它在胃癌[3]、肝癌[4]及乳腺癌[5]中的表達(dá)水平上調(diào)并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長及侵襲，提示miR-92a是一種潛在的促癌基因。目前，PDAC中miR-92a的表達(dá)量以及與臨床表現(xiàn)的關(guān)系尚未可知。本課題研究PDAC中miR-92a的表達(dá)情況，同時探討高表達(dá)miR-92a后胰腺癌細(xì)胞增殖以及凋亡的變化。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞及試劑

選取2014年1月—2016年1月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科收治并行手術(shù)切除的50例PDAC組織標(biāo)本及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本（距腫瘤切邊緣＞2 cm）。其中，男性35例，女性15例；年齡40～68歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行過放化療及腫瘤輔助治療。所有標(biāo)本于離體0.5 h內(nèi)取材，于液氮中固定保存。

胰腺癌PANC-1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫并由本院實(shí)驗室保存，miR-92a抑制性慢病毒顆粒（病毒載體類型：psi-LVRH1GP）購自廣州復(fù)能基因公司，DMEM（11965-084）、胎牛血清（16000044）均購自美國Gibco公司，Annexin V凋亡檢測試劑盒（FITC/PI雙染法，E606336）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Trizol試劑（15596026）、逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR， RT-PCR）試劑盒（Super Script ? One-Step RT-PCR System with Platinum? Taq DNA Polymerase, 10928042）及實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）試劑盒（DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit, F415L） 均 購自美國Invitrogen公司，兔抗人DAB2IP多克隆抗體（ab87811）購自美國Abcam公司，兔抗人β-actin單克隆抗體（#4970）購自美國CST公司，兔SP免疫組織化學(xué)（以下簡稱免疫組化）試劑盒由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 miR-92a基因相對含量的檢測

通過Trizol試劑提取標(biāo)本及細(xì)胞RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增體系。設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄條件：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃變性2 min，循環(huán)次數(shù)1次；94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，循環(huán)次數(shù)40次；72℃最終延伸10 min。通過2-△△Ct法檢測miR-92a基因的相對含量。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染

PANC-1于適宜環(huán)境中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代2～3代后進(jìn)行實(shí)驗。將PANC-1細(xì)胞過夜增殖至融合度達(dá)70%，接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×PBS溶液充分洗滌細(xì)胞。慢病毒感染分組：miR-92a抑制性慢病毒（anti-miR-92a）組每孔加入1 ml的miR-92a抑制性慢病毒上清液、2 ml完全培養(yǎng)基及15 μg聚凝胺（ploybrene）；對照組（anti-miR-con）每孔加入1 ml的陰性對照慢病毒上清液、2 ml完全培養(yǎng)基及15 μg ploybrene。轉(zhuǎn)染48 h后，使用含2 μg/ml嘌呤霉素（puromycin）的完全培養(yǎng)液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗檢測細(xì)胞增殖

PANC-1細(xì)胞按500個每孔均勻接種于6孔板中，每周更換完全培養(yǎng)基2次。培養(yǎng)2周后，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，1%結(jié)晶紫染色15 min，置于蒸餾水中洗去多余染液。風(fēng)干后將6孔板置于網(wǎng)格紙上計數(shù)每孔克隆形成數(shù)量，計算克隆形成率。每個樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

PANC-1細(xì)胞用預(yù)冷PBS工作液沖洗2次，胰酶消化細(xì)胞后1 500 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，預(yù)制緩沖液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個/ml，將500 μl細(xì)胞懸液與5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI混合，室溫遮光反應(yīng)10 min后上機(jī)測試。

1.6 裸鼠皮下移植瘤模型復(fù)制

10只5周齡BLAB/c裸鼠，隨機(jī)分為anti-miR-92a組和anti-miR-con組，每組5只，分組后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。分別取對數(shù)生長期的miR-92a敲除細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞，以冷PBS溶液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整終濃度為2.0×107個/ml。使用1 ml注射器，將0.2 ml細(xì)胞懸液（約含4.0×106個細(xì)胞）接種于裸鼠背部近右下肢處皮下組織內(nèi)，復(fù)制裸鼠皮下成瘤模型。裸鼠飼養(yǎng)4周，每周測量腫瘤長度及寬度，按公式1/2（長軸×短軸2）來計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。

1.7 western blotting檢測DAB2IP蛋白表達(dá)

通過RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，凝膠垂直電泳分離蛋白，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%牛血清白蛋白封閉1 h后將條帶孵育于1∶1 000比例稀釋的DAB2IP和β-actin一抗中。4℃過夜后，使用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育條帶1 h。ECL法曝光條帶。

1.8 免疫組化染色檢測DAB2IP蛋白表達(dá)

組織切片常規(guī)預(yù)處理后滴加1∶100稀釋的DAB2IP抗體，4℃孵育過夜。清洗殘余一抗后，使用HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合對應(yīng)的一抗，DAB法顯色。按文獻(xiàn)[6]所述方法，計算每張切片的免疫組化得分。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-92a在PDAC組織中的表達(dá)情況

miR-92a在PDAC組織中的表達(dá)水平（1.458±0.023）與癌旁組織中的表達(dá)水平（0.418±0.037）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.832，P=0.000），PDAC組織高于對應(yīng)癌旁組織。

2.2 miR-92a的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

PDAC組織中miR-92a高表達(dá)患者的腫瘤直徑較miR-92a低表達(dá)者更大（χ2=6.256，P=0.012）。

2.3 在體外下調(diào)miR-92a表達(dá)對PANC-1細(xì)胞增殖凋亡的影響

感染anti-miR-92a慢病毒的細(xì)胞內(nèi)miR-92a的表達(dá)水平較anti-miR-con組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.439，P=0.041）（見圖1A）。平板克隆實(shí)驗結(jié)果顯示，anti-miR-92a組克隆形成率為（35.13±7.81）%，低于anti-miR-con組的克隆形成率（86.25±8.19）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.452，P=0.033）（見圖1B）。同時下調(diào)miR-92a表達(dá)后，PANC-1細(xì)胞凋亡（37.14±4.51）較anti-miR-con組（12.35±3.64）升高（t=5.840，P=0.029）（見圖 1C）。

2.4 下調(diào)miR-92a表達(dá)后對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

兩組皮下注射腫瘤細(xì)胞后不同時間點(diǎn)的腫瘤體積比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)的腫瘤體積有差異（F=8.108，P=0.013）。②兩組腫瘤腫瘤體積有差異（F=10.034，P=0.009），anti-miR-92a組腫瘤腫瘤體積較anti-miR-con組小，miR-92a有抑制腫瘤生長作用。③兩組的腫瘤體積變化趨勢有差異（F=7.056，P=0.022）（見圖2A）。在飼養(yǎng)4周后anti-miR-92a組的最終腫瘤體積較anti-miR-con組下降（t=3.081，P=0.014）（見圖 2B、C）。

圖1 下調(diào)miR-92a表達(dá)對PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.5 下調(diào)miR-92a表達(dá)對DAB2IP表達(dá)的影響

沉默miR-92a抑制PANC-1細(xì)胞內(nèi)DAB2IP mRNA（t=4.427，P=0.040）及蛋白的表達(dá)水平（t=5.002，P=0.036）；同時下調(diào)miR-92a表達(dá)的移植瘤組織內(nèi)DAB2IP蛋白的表達(dá)水平也降低（t=3.161，P=0.013）。見圖3。

圖2 下調(diào)miR-92a表達(dá)對PANC-1細(xì)胞移植瘤生長的影響

圖3 下調(diào)miR-92a表達(dá)對DAB2IP表達(dá)的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PDAC組織中miR-92a的表達(dá)水平高于癌旁組織。提示miR-92a在胰腺癌中可能是一種被上調(diào)的促癌因子。不同的體外及體內(nèi)研究表明，抑制miR-92a的表達(dá)能夠削弱細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在動物實(shí)驗中，也發(fā)現(xiàn)抑制miR-92a表達(dá)的PANC-1細(xì)胞在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞的生長。miR-92a可能是一種具有多項促癌功能的microRNA，最新文獻(xiàn)也指出，miR-92a也具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7]及增強(qiáng)化療抵抗[8]的作用。類似報道的結(jié)果值得大家在今后的工作中進(jìn)一步深入研究miR-92a的生物學(xué)功能。

MicroRNA能夠通過結(jié)合靶基因3'-UTR區(qū)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。筆者通過生物信息學(xué)檢索分析發(fā)現(xiàn)，凋亡誘導(dǎo)因子DAB2IP mRNA的3'-UTR區(qū)存在miR-92a的結(jié)合位點(diǎn)。既往研究[9]也表明，DAB2IP在胰腺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)降低且具有抑癌作用，其可能是miR-92a的潛在靶點(diǎn)之一。通過PCR及Western blotting發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-92a在體外能促進(jìn)DAB2IP的表達(dá)，進(jìn)一步通過免疫組化發(fā)現(xiàn)沉默miR-92a表達(dá)的移植瘤組織中DAB2IP的表達(dá)也出現(xiàn)恢復(fù)性升高。研究指出，DAB2IP能夠下調(diào)包括Ras-Raf-ERK[10]和PI3KAkt[11]在內(nèi)的許多促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的信號通路的活性。提示miR-92a的促進(jìn)腫瘤生長作用可能是與解除DAB2IP對多條激酶信號通路的抑制有關(guān)。

綜上所述，miR-92a在胰腺癌中高表達(dá)，沉默miR-92a可能通過恢復(fù)DAB2IP的表達(dá)而抑制胰腺癌細(xì)胞生長。