董峰，牛躍平，鄭英斌，高健

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 普外科，河南 鄭州 450014）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其早期癥狀不典型，診斷率低，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于進(jìn)展期。我國(guó)胃癌的年病死率為25.21/10萬，在各系統(tǒng)惡性腫瘤的死因中居首位。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲過程中，微血管的生成起到至關(guān)重要的作用。在腫瘤微血管形成過程中，需要多種促進(jìn)因子及抑制因子的共同調(diào)控，本文通過研究水通道蛋白1（aquaporin-1, AQP1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、微血管密度（microvessel density, MVD）在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，以期為胃癌個(gè)體化治療及其預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月1日—2 017年6月1日鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院進(jìn)展期胃癌行胃癌根治術(shù)新鮮標(biāo)本79例。男性49例，女性30例；年齡28～81歲，中位57歲；術(shù)前均未行放化療。每例分別取癌組織和癌旁組織（距腫瘤邊緣＜2 cm處），放置于中心實(shí)驗(yàn)室的-80℃冰箱中保存。術(shù)后病理分期，按第7版UICC-AJCC胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期13例，Ⅱ期21例，Ⅲ期38例，Ⅳ期7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；脈管癌栓陽性43例，脈管癌栓陰性36例。按分化程度：高分化癌11例，中分化癌24例，低分化癌39例，未分化癌5例。

1.2 主要材料及試劑

AQP1兔抗人多克隆抗體、兔抗人VEGF多克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、SP染色試劑盒及濃縮型DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

所有標(biāo)本經(jīng)過4%的多聚甲醛固定后，脫水，透明化處理，石蠟包埋后，連續(xù)切片（4 μm）。常規(guī)脫蠟，水化后，采取免疫組織化學(xué)二步法（SP染色），操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書，DAB染色，蘇木精復(fù)染，干燥后脫水，透明，封片。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照，以已知陽性結(jié)果做為陽性對(duì)照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

AQP 1：以細(xì)胞膜被染色為棕黃色為陽性，VEGF：陽性為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)上出現(xiàn)黃色或棕黃色染色，每個(gè)切片有大于5%的胞膜或胞質(zhì)染色，即可判定為VEGF陽性表達(dá)。MVD：首先在低倍鏡（×40）下選取血管密集區(qū)，然后在高倍鏡（×200）下選取3個(gè)視野，對(duì)新生血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后取其平均值即為MVD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，運(yùn)用Spearman進(jìn)行組間相關(guān)性分析，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP1、VEGF、MVD在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá)

AQP1、VEGF在胃癌組織的表達(dá)與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），胃癌組織的表達(dá)高于癌旁組織組；MVD在胃癌組織的表達(dá)與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），胃癌組織的表達(dá)高于癌旁組織。見附圖和表1。

附圖 AQP1、VEGF、MVD在胃癌組織中的表達(dá) （×200）

表1 AQP1、VEGF、MVD在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá) （n =79）

2.2 AQP1與VEGF相關(guān)性分析

在AQP1陰性表達(dá)的胃癌組織中，V EGF陽性表達(dá)率為33.33%（7例），在AQP1陽性表達(dá)的胃癌組織中，VEGF陽性表達(dá)率為84.48%（49例），通過Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，AQP1與VEGF在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.497，P＜0.05）。見表2。

2.3 AQP1及VEGF與MVD在胃癌組織中表達(dá)比較

AQP1陽性表達(dá)的胃癌組織MVD值與AQP1陰性表達(dá)的胃癌組織MVD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MVD在AQP1陽性表達(dá)的胃癌組織中的表達(dá)高于AQP1陰性表達(dá)的組織。VEGF陽性表達(dá)的胃癌組織MVD值與VEGF陰性表達(dá)的胃癌組織中MVD表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MVD在VEGF陽性表達(dá)的胃癌組織中的表達(dá)高于AQP1陰性表達(dá)的組織。見表3。

表2 AQP1與VEGF相關(guān)性分析 例

表3 AQP1及VEGF與MVD在胃癌組織中表達(dá)比較（±s）

表3 AQP1及VEGF與MVD在胃癌組織中表達(dá)比較（±s）

組別 n MVD值 t值 P值A(chǔ)QP1陽性 58 44.16±4.52-8.146 0.000陰性 21 34.80±4.44 VEGF陽性 56 44.31±4.65-8.260 0.000陰性 23 35.17±3.98

表4 AQP1、VEGF的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例（%）

2.4 AQP1、VEGF與MVD的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的比較

AQP1、VEGF的表達(dá)與胃癌的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及分期有關(guān)（P＜0.05），與腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）（見表4）；MVD的表達(dá)與胃癌的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及分期有關(guān)（P＜0.05），與腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）（見表 5）。

表5 MVD的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 （±s）

表5 MVD的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 （±s）

臨床病理參數(shù) n MVD值 t值 P值腫瘤大小≤5 cm 47 42.15±6.03 8.920 0.375＞5 cm 32 40.90±6.21分化程度高、中分化 35 37.82±4.70 5.980 0.000低、未分化 44 44.69±5.35淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有51 43.15±5.79 3.111 0.003無28 38.91±5.78脈管癌栓有43 45.87±3.44 10.324 0.000無36 36.60±4.53分期Ⅰ、Ⅱ期 34 36.34±4.26 10.303 0.000Ⅲ、Ⅳ期 45 45.62±3.76

3 討論

在動(dòng)植物及微生物的體內(nèi)存在一種特異性水通道蛋白，被稱作水通道蛋白（Aquaporins, AQPs），其廣泛分布于機(jī)體的多個(gè)器官，以滿足機(jī)體組織的生理需求，且其在細(xì)胞的生命活動(dòng)及凋亡過程中，也發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]AQP1與如乳腺癌、膀胱癌、喉癌、黑色素瘤等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。趙子偉等[3]在研究過程中發(fā)現(xiàn)AQP1在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，提示AQP1對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)又有研究[4]指出VEGF與AQP1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)比癌旁組織高，且具有一定相關(guān)性，推測(cè)在腫瘤的生長(zhǎng)過程中，AQP1通過與VEGF的互相作用，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。本研究中AQP1在胃癌組表達(dá)陽性率高于癌旁組織中陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；胃癌組織中AQP和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有協(xié)同作用。

在人體內(nèi)，多種細(xì)胞均能表達(dá)VEGF，在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)新生血管形成及調(diào)節(jié)血管的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，是目前己知的最重要的血管活性因子之一，而血管的生成在癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。SIMONETTI等[5]發(fā)現(xiàn)VEGF在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織，認(rèn)為VEGF能促進(jìn)腫瘤微血管形成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中，胃癌組織中VEGF的表達(dá)高于癌旁組織；VEGF陽性表達(dá)的胃癌組織中的MVD表達(dá)高于VEGF陰性表達(dá)的組織，推測(cè)VEGF與MVD在胃癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，VEGF參與腫瘤新生血管形成，在癌變形成及以后的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過程中起重要的作用。

MVD能良好的反應(yīng)腫瘤微血管生成的狀態(tài)，目前已被廣泛應(yīng)用與臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中。在多種惡性腫瘤組織中MVD均為高表達(dá)，但在正常器官、組織和大血管等位置，其表達(dá)能力降低[6]。GRIGORE等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤中的MVD表達(dá)程度高，其與腫瘤微血管形成關(guān)系密切。本研究中的胃癌組織中MVD與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明MVD與惡性腫瘤關(guān)系密切，其可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在研究胃癌組織中MVD與AQP1表達(dá)時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)有關(guān)兩者間相關(guān)性的研究尚少，但本實(shí)驗(yàn)中AQP1陽性表達(dá)的胃癌組織中，MVD表達(dá)高于AQP1陰性表達(dá)的組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故可預(yù)測(cè)在胃癌組織中，AQP1與MVD的表達(dá)可能存在正相關(guān)關(guān)系，兩者共同參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，但相關(guān)資料尚不足，有待進(jìn)一步研究。

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，需要大量的水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的AQP1可改變腫瘤的形態(tài)、體積及細(xì)胞上皮滲透壓，從而協(xié)助腫瘤的生長(zhǎng)，加快腫瘤向周圍組織浸潤(rùn)[8]。CHANG等[9]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中VEGF和MVD表達(dá)強(qiáng)度與Borrmann型、腫瘤分化、腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，VEGF和MVD高表達(dá)的患者總體生存率低于VEGF和MVD低表達(dá)的患者。CARVALHO等[10]報(bào)道MVD表達(dá)程度高的乳腺癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增高；另一些研究顯示，隨著MVD的增加，腫瘤的生成，侵襲和轉(zhuǎn)移率也都增加[11]。本研究中結(jié)果與上述報(bào)道一致，AQP1、VEGF與MVD的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤大小無關(guān)，但與胃癌的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及分期關(guān)系密切，推斷3者在腫瘤的生成、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中有促進(jìn)及協(xié)同作用。

綜上所述，AQP1、VEGF與MVD在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，3者之間存在協(xié)同作用，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，因此本研究可為腫瘤的預(yù)后評(píng)估提供一定的臨床資料。此外，在抗腫瘤藥物中，大多數(shù)研究都與新的靶點(diǎn)有關(guān)，靶向藥物的開發(fā)層出不窮，以期推出新的高效靶向藥物，但仍不能挽救多數(shù)晚期腫瘤患者，更無法徹底治愈腫瘤，故仍需繼續(xù)深入研究，深層次探究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為腫瘤的治療提供新的思路。