程小珍，李曉東，王順蘭，謝宗宙，毛山山，朱燕興，崔榮花，王美清

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 腫瘤化療科，海南 海口 570208；2.加州大學(xué)戴維斯分校-醫(yī)學(xué)院 臨床免疫研究室，美國(guó) 加州 CA95817；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570208）

原發(fā)性肝癌的全球發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2020年肝癌新發(fā)病例將上升至95 374例[1]。在全球癌癥死亡原因中排名第3位[2]。我國(guó)是肝癌的高發(fā)地，其發(fā)病率和病死率均占世界首位。原發(fā)性肝癌惡性程度高，早期多無(wú)明顯的癥狀和體征，出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)多處于中晚期，導(dǎo)致約80%的患者就診時(shí)已無(wú)法行根治性手術(shù)切除，非手術(shù)治療以肝動(dòng)脈介入栓塞化 療（transcatheter arterial chemoembolization, TACE）為首選，生存期可獲得明顯延長(zhǎng)。自2008年以來(lái)索拉非尼藥物治療成為晚期肝癌患者標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方法，能延長(zhǎng)晚期肝癌患者近3個(gè)月生存期[3]。肝癌對(duì)放化療均相對(duì)不敏感，治療效果差，新興的免疫治療給肝癌患者帶來(lái)新的曙光，近年來(lái)程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）和程序性死亡配體（programmed death ligand 1, PD-L1）作為免疫治療新的靶點(diǎn)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究熱點(diǎn)之一。

PD-1，又稱(chēng)CD279，為CD28免疫球蛋白超家族成員，是一種重要的免疫抑制分子。PD-L1，又稱(chēng)CD274或B7-H1（B7 homolog 1），是B7家族中一個(gè)負(fù)性T細(xì)胞共刺激分子。目前研究結(jié)果表明，表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與表達(dá)于CD8+T細(xì)胞表面的受體PD-1的結(jié)合后，可以在體外抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes, CTL）的凋亡和耗竭，從而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫和介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[4]。

關(guān)于PD-1與PD-L1的體內(nèi)研究，目前主要集中在采用免疫組織化學(xué)來(lái)檢測(cè)惡性腫瘤組織標(biāo)本，關(guān)于惡性腫瘤治療前后外周血PD-1和PD-L1表達(dá)變化的研究較少，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)關(guān)于肝癌患者介入治療前后外周血PD-1和PD-L1表達(dá)變化及臨床意義研究的報(bào)道。既往研究顯示，多種惡性腫瘤組織如非小細(xì)胞肺癌[5-6]、胃癌[7]、肝癌[8]、乳腺癌[9]、宮頸癌等[10]患者組織標(biāo)本中PD-1和PD-L1表達(dá)升高，且高水平PD-1和PD-L1可能與腫瘤的惡性程度高、腫瘤分期晚、預(yù)后差有關(guān)，但PD-L1與各種不同惡性腫瘤預(yù)后之間的相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議[11]。因原發(fā)性肝癌患者手術(shù)標(biāo)本獲取不易，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TACE治療前后肝癌患者外周血CD4+T、CD8+T及抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cells, APC）表面PD-1和PD-L1表達(dá)變化，并分析PD-1和PD-L1表達(dá)與患者細(xì)胞分化程度、療效的關(guān)系，探討PD-1和PD-L1與腫瘤進(jìn)展及療效的關(guān)系，為肝癌患者的免疫治療提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年1月—2016年12月中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院臨床資料完整的28例有TACE治療指征的中晚期肝癌患者（肝癌組）。均經(jīng)臨床及病理組織學(xué)檢查確診為原發(fā)性肝癌，且無(wú)手術(shù)指征。其中，男性25例，女性3例；年齡36～71歲，中位年齡57歲；病理類(lèi)型均為肝細(xì)胞癌，高-中分化16例，低分化12例。所有患者肝、腎、心、肺功能基本正常，KPS評(píng)分＞60分，預(yù)計(jì)生存期＞3個(gè)月，且無(wú)合并自身免疫性疾病。所有患者或法定代理人知情并簽署知情同意書(shū)，并報(bào)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選取同時(shí)期體檢的年齡、性別相匹配的健康志愿者20例為對(duì)照組。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑與材料 熒光抗體PerCP-Cy5.5-CD4、APC-H7-CD8、PE-PD-1、PE-Cy7-PD-L1、APC-CD85g（ILT7）、FITC-CD149（美國(guó)BD 公司），紅細(xì)胞裂解液（FACS Lysing Solution，美國(guó)BD公司）、淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Cell Grow公司），F(xiàn)ACS Canto流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2.2 TACE治療 所有患者均采用Seldinger技術(shù)經(jīng)股動(dòng)脈穿刺行動(dòng)脈灌注化療，化療方案為：吡柔比星25～40 mg/m2+奧沙利鉑100～130 mg/m2，將碘油與化療藥混勻制成乳劑行遠(yuǎn)側(cè)栓塞，依腫瘤的大小一般用碘油5～20 ml，注入適量的明膠海綿行近側(cè)栓塞。

1.2.3 PD-1和PD-L1檢測(cè) 在TACE治療前、治療后1個(gè)月內(nèi)采集肝癌患者外周血5～10 ml。流式管加混勻全血80 μl，加預(yù)先按比例混合的熒光抗體（18 μl，共6種），蝸旋混勻，避光室溫45 min；加1.2 ml紅細(xì)胞裂解液，蝸旋1 min，避光室溫15 min；2 100 r/min離心5 min，棄上清液，加PBS 1.5 ml，蝸旋，2 100 r/min離心5 min，棄上清液，加300～400 μl固定液（1%多聚甲醛PFA，4℃保存），2 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.3 療效評(píng)價(jià)

治療前1周、治療后3個(gè)月評(píng)價(jià)療效，常規(guī)行肝臟彩超/CT/MRI、胸部CT檢查，對(duì)比治療前后腫瘤大小變化。按《常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》來(lái)評(píng)價(jià)肝癌患者的療效，顯效（PR）：腫瘤縮?。?0%；有效（PC）：腫瘤縮小介于25%～50%；穩(wěn)定（NC）：腫瘤縮?。?5%；進(jìn)展（PD）：腫瘤增大＞25%，并有新病灶出現(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血PD-1、PD-L1表達(dá)比較

肝癌組患者外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、APC PD-1、CD4+PD-L1、CD8+PD-L1及 APC PD-L1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肝癌組均高于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

2.2 肝癌組治療前后外周血PD-1、PD-L1表達(dá)比較

肝癌組患者經(jīng)TACE治療后1個(gè)月內(nèi)外周血CD4+T、CD8+T及APC表面PD-L1水平與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療后較治療前下降，CD4+T、CD8+T及APC表面PD-1表達(dá)也較治療前下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 肝癌組外周血PD-1、PD-L1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度的關(guān)系

細(xì)胞分化差的肝癌組患者外周血PD-1、PD-L1表達(dá)較高，以CD8+T細(xì)胞表面的PD-1、PD-L1表達(dá)升高最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 PD-1、PD-L1表達(dá)與療效的關(guān)系

肝癌組患者經(jīng)TACE治療后3個(gè)月，治療有效（PR+PC+NC）的患者有15例，腫瘤進(jìn)展（PD）的13例，其中腫瘤進(jìn)展者PD-L1表達(dá)高于治療有效的患者，CD8+PD-L1表達(dá)升高比較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表 4。

表1 兩組外周血PD-1、PD-L1表達(dá)比較 （±s）

表1 兩組外周血PD-1、PD-L1表達(dá)比較 （±s）

組別 n CD4+ PD-1 CD8+ PD-1 APC PD-1 CD4+ PD-L1 CD8+ PD-L1 APC PD-L1肝癌組 28 8.97±4.49 3.18±0.78 2.70±0.78 11.18±1.32 50.52±18.09 32.12±2.91健康組 20 4.51±1.58 1.01±0.64 0.98±0.37 5.09±1.53 8.37±2.76 13.09±4.34 t值 9.980 19.130 6.740 8.260 128.460 64.650 P值 0.003 0.000 0.014 0.007 0.000 0.000

表2 肝癌組治療前后外周血PD-1、PD-L1表達(dá)比較 （n =28，±s）

表2 肝癌組治療前后外周血PD-1、PD-L1表達(dá)比較 （n =28，±s）

時(shí)間 CD4+ PD-1 CD8+ PD-1 APC PD-1 CD4+ PD-L1 CD8+ PD-L1 APC PD-L1治療前 8.97±4.49 3.18±0.78 2.70±0.78 11.18±1.32 50.52±18.09 32.12±2.91治療后 7.43±4.28 2.76±3.36 1.85±1.59 5.78±2.40 29.77±14.36 17.37±2.67 t值 0.540 1.230 4.170 7.500 38.800 44.280 P值 0.470 0.276 0.051 0.011 0.000 0.000

表3 肝癌組外周血PD-1、PD-L1表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系 （±s）

表3 肝癌組外周血PD-1、PD-L1表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系 （±s）

分化程度 n CD4+ PD-1 CD8+ PD-1 APC PD-1 CD4+ PD-L1 CD8+ PD-L1 APC PD-L1高 - 中分化 16 9.26±5.20 0.80±0.96 1.47±1.05 3.91±2.58 29.39±29.54 30.48±25.43低分化 12 9.10±5.70 5.08±4.71 1.80±1.68 14.64±21.24 67.30±31.19 35.71±19.13 t值 0.080 3.090 -0.650 -2.010 -3.280 0.620 P值 0.939 0.005 0.519 0.055 0.003 0.539

表4 肝癌組外周血PD-1、PD-L1表達(dá)與療效的關(guān)系 （±s）

表4 肝癌組外周血PD-1、PD-L1表達(dá)與療效的關(guān)系 （±s）

療效評(píng)價(jià) n CD4+ PD-1 CD8+ PD-1 APC PD-1 CD4+ PD-L1 CD8+ PD-L1 APC PD-L1 PR+PC+NC 15 7.73±3.67 2.13±3.76 1.54±1.23 5.83±5.53 28.04±27.08 28.08±20.82 PD 13 10.87±6.49 4.21±4.38 1.69±1.49 11.60±20.80 65.95±33.37 38.13±22.18 t值 -1.600 1.340 -0.290 0.180 7.240 1.230 P值 0.122 0.193 0.772 0.675 0.012 0.229

3 討論

原發(fā)性肝癌惡性程度高、治療效果差、危害大，目前尚無(wú)特效的治療方法和有效的療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)，綜合使用介入、化療、免疫、分子靶向等治療是目前提高腫瘤局部控制率、改善療效、延長(zhǎng)生存期的主要方法，迫切需要新的治療手段來(lái)改善患者預(yù)后。PD-1和PD-L1是一對(duì)負(fù)性免疫共刺激分子，因其參與T淋巴細(xì)胞活化、介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，也是腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)之一。

生理情況下，組織細(xì)胞表面的PD-L1與淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合后，可抑制淋巴細(xì)胞功能，誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡，在維持外周T淋巴細(xì)胞耐受和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用，從而避免自身免疫性疾病的發(fā)生[13]。到目前為止，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法已經(jīng)在多種惡性腫瘤組織表面檢測(cè)到PD-L1高表達(dá)，PD-L1可與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，可抑制淋巴細(xì)胞的功能及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而抵抗淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸[14]。但PD-1和PD-L1表達(dá)與各種惡性腫瘤患者預(yù)后關(guān)系尚不明確，比如在肝癌、胃癌患者中高表達(dá)PD-L1患者預(yù)后不良，在乳腺癌患者中高表達(dá)PD-L1則對(duì)預(yù)后有益，而在非小細(xì)胞肺癌[15-16]中高表達(dá)PD-L1預(yù)測(cè)預(yù)后作用存在爭(zhēng)議。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝癌組患者外周血CD4+T、CD8+T及APC表面PD-1、PD-L1表達(dá)高于對(duì)照組，與既往研究結(jié)果一致[17-18]。本研究還發(fā)現(xiàn)，肝癌組患者治療前PD-1和PD-L1表達(dá)升高，經(jīng)過(guò)治療后PD-1和PD-L1表達(dá)下降，與ZENG等[19]的研究結(jié)果一致，但PD-L1表達(dá)下降較明顯，且PD-1、PD-L1表達(dá)與腫瘤組織分化程度有關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化差的患者外周血PD-1、PD-L1表達(dá)較高。因本研究樣本例數(shù)較少，未能進(jìn)一步分析PD-1、PD-L1表達(dá)與患者年齡、性別、AFP等指標(biāo)之間的關(guān)系，需要在今后進(jìn)一步加大樣本量來(lái)研究，以獲得更多的關(guān)于PD-1和PD-L1表達(dá)與患者臨床生物學(xué)特征之間相關(guān)性的信息。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后療效好的患者外周血PD-1、PD-L1表達(dá)較低，考慮治療后療效好的患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷減少更明顯所致，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)外周血PD-1和PD-L1表達(dá)可能預(yù)測(cè)患者療效。既往有研究報(bào)道PD-L1表達(dá)與患者腫瘤的侵襲性、血管侵犯等有關(guān)，考慮細(xì)胞分化差、惡性程度高的腫瘤侵襲性更強(qiáng)、更容易出現(xiàn)血管侵犯，也更容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和疾病不容易控制[20-21]。筆者推測(cè)，TACE阻斷腫瘤血管可能減少腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步降低PD-L1表達(dá)，對(duì)于治療效果不好的患者聯(lián)合使用抑制腫瘤血管生成的藥物可能可以進(jìn)一步降低PD-L1表達(dá)，從而可能進(jìn)一步增加治療效果。

綜上所述，肝癌患者外周血PD-1、PD-L1表達(dá)升高，且與細(xì)胞分化、治療效果有關(guān)，嚴(yán)密及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者外周血PD-1、PD-L1表達(dá)變化可能可以預(yù)測(cè)患者療效、預(yù)后情況，同時(shí)可能根據(jù)PD-1、PD-L1表達(dá)與患者更多的臨床生物學(xué)特征篩選出對(duì)TACE及免疫治療效果更好的病例，為肝癌患者免疫治療提供理論基礎(chǔ)。