郝宇卉，李美寧，張凱麗，楊麗紅，劉志貞

(1.忻州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)系，山西 忻州 034000；2.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001)

由于骨組織再生能力極其有限，骨損傷修復(fù)成為目前臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。骨組織工程學(xué)是在探索骨損傷修復(fù)治療模式基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，其包括三大要素，即種子細(xì)胞、支架及誘導(dǎo)因子，其中種子細(xì)胞是骨損傷修復(fù)治療的基礎(chǔ)[1-2]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）因其組織來源豐富，免疫原性低，具有較強(qiáng)的增殖與分化潛能和免疫調(diào)節(jié)作用，逐漸成為較為理想的種子細(xì)胞，在骨損傷修復(fù)領(lǐng)域取得較大研究進(jìn)展[3-4]。脂肪干細(xì)胞是來源于脂肪組織的MSCs，相對于其他組織來源的MSCs，脂肪干細(xì)胞取材更為方便，創(chuàng)傷小，可極大降低實(shí)驗(yàn)成本。此外，脂肪組織中脂肪干細(xì)胞含量豐富，具有極強(qiáng)的增殖分化能力，可分化為成骨細(xì)胞，較易體外培養(yǎng)，適合作為骨組織工程學(xué)的種子細(xì)胞[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞在治療骨缺損和骨折中具有顯著效果[8-9]。原代脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法有多種，常用的方法包括膠原酶消化法和組織塊貼壁法[10]，不同培養(yǎng)方法對脂肪干細(xì)胞成骨分化是否有影響，目前尚無定論。本實(shí)驗(yàn)分別采用膠原酶消化法和組織塊貼壁法對小鼠脂肪干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，對兩種方法所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定并對其增殖能力、成骨分化能力進(jìn)行比較，以期尋找更適合體外培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法，為骨組織損傷修復(fù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

無特定病原體（SPF）級6～8周齡雌性BALB/c小鼠8只，體重20～25 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。L-DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、10%胎牛血清（美國Gibco公司）、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）、EDTA（美國Gibco公司）、TRYPSIN 1∶250（北京索萊寶科技有限公司），成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合（廣州賽業(yè)生物科技有限公司），Anti-Ly-6A/E（Sca-1）PE、Anti-CD44 PE、Anti-CD31 （PECAM）FITC（美國eBioscience公司），磷酸鹽緩沖溶液（PBS）粉劑（北京索萊寶科技有限公司），I型膠原酶、油紅O染液、茜素紅染液（美國Sigma公司），堿性磷酸酶試劑盒-ALP（金氏法）（北京北化康泰臨床試劑有限公司），鈣含量比色檢測分析試劑盒（美國Bio Vision公司），其余試劑如多聚甲醛、CCK-8試劑盒、二甲基亞砜、生理鹽水均購自上海生工生物工程股份有限公司，為國產(chǎn)分析純。

低溫冰箱（合肥中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司），恒溫水浴箱（上海應(yīng)用恒溫設(shè)備廠），電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），超純水制備儀（美國Millipore公司），外科手術(shù)器械（上海醫(yī)療器械廠），移液器（北京吉爾森科技有限公司），超凈工作臺（安徽航天生物科技），流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），普通光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司），其他耗材如EP管、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等均購自美國Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 脫頸處死實(shí)驗(yàn)小鼠，常規(guī)脫毛備皮，固定于實(shí)驗(yàn)臺上，消毒皮膚，沿腹股溝、腹白線剪開皮膚，暴露皮下組織，仔細(xì)剝離腹部、腹股溝皮下脂肪組織，收集于盛PBS液（含雙抗）的培養(yǎng)皿中，皿置于冰上。

組織塊貼壁法：將分離的脂肪組織用手術(shù)剪剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，用含雙抗的PBS沖洗組織塊3次，將組織塊按一定間距轉(zhuǎn)入L-DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理過的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，靜置30～40 min，加入少量L-DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素），置于37℃ 5%二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁情況，定期更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合達(dá)90%后進(jìn)行傳代。

膠原酶消化法：將收集的脂肪組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，加入適量0.075% I型膠原酶，37℃恒溫水浴50 min，等體積L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，L-DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素）重懸，過濾，等量接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃ 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，定期換液，待細(xì)胞融合達(dá)90%后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 脂肪干細(xì)胞形態(tài)觀察 稱取同等重量的脂肪組織，分別用上述兩種方法培養(yǎng)，選擇第3代生長狀態(tài)較好的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)。脂肪干細(xì)胞形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，呈長梭形，胞漿豐富，核偏大，貼壁生長，呈旋渦狀。

1.2.3 脂肪干細(xì)胞生長曲線分析 分別取上述兩種培養(yǎng)方法所得生長狀態(tài)良好的第3代脂肪干細(xì)胞，胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度均以1×104個/孔接種到24孔板，對照組不接種細(xì)胞加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，按說明書進(jìn)行操作，連續(xù)7 d，每天檢測1個24孔板，酶標(biāo)儀檢測光密度（OD）值，繪制這兩種不同培養(yǎng)方法所得細(xì)胞的生長曲線。

1.2.4 脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測 分別取上述兩種培養(yǎng)方法下生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物Sca-1、CD44、CD31檢測。將細(xì)胞用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107個/ml，各取50 μl細(xì)胞懸液到流式管中，分別加入50 μl稀釋好的待檢抗體，4℃避光孵育1 h，每管加入緩沖液2 ml，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清，PBS沖洗，0.2 ml緩沖液重懸細(xì)胞后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測。

1.2.5 脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化能力檢測 分別選取上述兩種培養(yǎng)方法所得第3代細(xì)胞，胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液，兩組分設(shè)陰性對照組，繼續(xù)用L-DMEM培養(yǎng)；兩種培養(yǎng)方法的誘導(dǎo)組以2×105個/cm3密度分別接種于2個6孔板，每孔加等量L-DMED培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長滿時換等量成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液，培養(yǎng)3 d換成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液，培養(yǎng)24 h后再換為等量A液，如此循環(huán)，10 d后顯微鏡下觀察脂滴形成情況，再換為B液培養(yǎng)3 d，去培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，油紅O染色40 min，PBS洗去染液，顯微鏡下觀察。

1.2.6 脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化能力檢測 分別取上述兩種培養(yǎng)方法所得生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液，以3×105個/cm3密度接種于明膠預(yù)處理過的6孔板，陰性對照組加入L-DMEM培養(yǎng)，誘導(dǎo)組加入成骨誘導(dǎo)液2 ml，每3天換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定，室溫放置30 min，PBS洗滌2次，茜素紅染液染色20 min，PBS洗滌。顯微鏡下觀察細(xì)胞成骨分化情況，分別選取5個不同視野拍照，用于圖像分析，采集礦化結(jié)節(jié)面積、視野面積。應(yīng)用公式（礦化結(jié)節(jié)面積/視野面積×100%）計(jì)算礦化面積百分比。

1.2.7 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測 分別取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d的兩組細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞，超聲細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞，離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，按照ALP說明書操作，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組樣本均稀釋10倍，分5份在520 nm波長下測定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得每一份樣本濃度并乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出各組ALP活性濃度。

1.2.8 鈣離子濃度檢測 分別取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d的兩組細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入0.5 mol/L HCl常溫下過夜，使細(xì)胞中鈣鹽分解為鈣離子。兩組樣本各分5份，按鈣含量比色檢測分析試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。首先通過標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值獲得鈣含量值（μg/well），再通過公式C=Sa/Sv（mg/dl）計(jì)算出鈣離子濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件、Image Pro Plus 6.0軟件和Prism 5作圖軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪干細(xì)胞形態(tài)比較

組織塊貼壁法培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，第3天時，組織塊邊緣開始出現(xiàn)少量細(xì)胞，貼壁生長，呈短梭形、多角形或者圓形（見圖1A）；培養(yǎng)第10天，細(xì)胞生長迅速，融合達(dá)80%。膠原酶消化法培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，第20小時，細(xì)胞開始逐漸貼壁生長，第3天，細(xì)胞生長增快，呈短梭形、三角形（見圖1B），培養(yǎng)第7天，細(xì)胞融合達(dá)80%左右。兩種方法所得脂肪干細(xì)胞，傳代后生長迅速，傳至第3代，可見細(xì)胞形態(tài)均一，均呈長梭形，漩渦樣生長（見圖1C、1D）。培養(yǎng)至第10代，細(xì)胞均開始老化，形態(tài)出現(xiàn)變化。

圖1 脂肪干細(xì)胞生長情況

2.2 脂肪干細(xì)胞生長曲線比較

兩種方法所得的脂肪干細(xì)胞在第4、5、6和7天的增殖情況進(jìn)行比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①各時間點(diǎn)的增殖情況有差異（F=0.562，P=0.000）。②兩種培養(yǎng)方法所得細(xì)胞的增殖情況有差異（F=0.221，P=0.000），從第4天開始，組織塊貼壁法培養(yǎng)所得細(xì)胞的增殖情況高于膠原酶消化法。③兩種培養(yǎng)方法所得細(xì)胞增殖的變化趨勢有差異（F=0.613，P=0.000）。從生長曲線可以看出，細(xì)胞生長具有滯留期、對數(shù)生長期和平臺期。見附表和圖2。

附表 兩種方法所得脂肪干細(xì)胞各時間點(diǎn)的增殖狀況比較 （n =5，±s）

附表 兩種方法所得脂肪干細(xì)胞各時間點(diǎn)的增殖狀況比較 （n =5，±s）

方法 第4天 第5天 第6天 第7天組織塊貼壁法 0.51±0.49 0.72±0.67 0.80±0.74 0.82±0.67膠原酶消化法 0.39±0.37 0.56±0.56 0.60±0.54 0.61±0.59

圖2 兩種方法所得脂肪干細(xì)胞生長曲線 （±s）

2.3 脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測結(jié)果

組織塊貼壁法所得脂肪干細(xì)胞CD44表達(dá)率為98.57%，Sca-1表達(dá)率為95.16%，CD31表達(dá)率為7.09%。膠原酶消化法所得脂肪干細(xì)胞CD44表達(dá)率為95.83%，Sca-1表達(dá)率為92.72%，CD31表達(dá)率為7.04%。見圖3。

圖3 兩種方法所得脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測結(jié)果

2.4 脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)結(jié)果

從第5天開始可見脂滴形成，第7～9天，脂滴形成量增多，呈融合趨勢，油紅O染色呈陽性，陰性對照組染色為陰性，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞。見圖4。

2.5 脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)結(jié)果

誘導(dǎo)15 d后，陰性對照組茜素紅染色陰性，誘導(dǎo)組可見礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色后證實(shí)為礦化結(jié)節(jié)。組織塊貼壁法培養(yǎng)所得脂肪干細(xì)胞礦化面積百分率[（30.10±2.03）%]高于膠原酶消化法[（12.03±1.22）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.071，P=0.000）。見圖5。

圖4 兩種方法所得脂肪干細(xì)胞成脂分化結(jié)果 （×100）

圖5 兩種方法所得脂肪干細(xì)胞成骨分化結(jié)果

2.6 脂肪干細(xì)胞ALP活性檢測結(jié)果

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天后，兩種培養(yǎng)方法所得脂肪干細(xì)胞ALP活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.338，P=0.002），與膠原酶消化法比較，組織塊貼壁法所得脂肪干細(xì)胞ALP活性更高，見圖6A。

2.7 脂肪干細(xì)胞鈣離子濃度檢測結(jié)果

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天后，兩種培養(yǎng)方法所得脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣離子濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.430，P=0.000），與膠原酶消化法比較，組織塊貼壁法所得細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣離子濃度活性更高。見圖6B。

圖6 兩種方法所得脂肪干細(xì)胞成骨分化能力檢測結(jié)果（±s）

3 討論

脂肪干細(xì)胞作為骨損傷修復(fù)的種子細(xì)胞，在細(xì)胞治療領(lǐng)域有很大潛能[11-19]。但關(guān)于不同培養(yǎng)方法對其成骨分化能力的影響，目前鮮有報(bào)道。骨損傷定義為由于各種因素包括感染、外傷、腫瘤等引起的骨質(zhì)破壞與缺損[20]。由于骨的再生能力極其有限，骨損傷修復(fù)成為骨科醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)等研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[21-22]。近年來，骨組織工程的興起為骨損傷修復(fù)研究帶來曙光，種子細(xì)胞作為骨組織工程學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，受到眾研究學(xué)者的青睞[23]。脂肪干細(xì)胞因其取材方便，創(chuàng)傷小，實(shí)驗(yàn)成本低，體外較易培養(yǎng)及強(qiáng)大的增殖分化能力，包括成骨分化能力，逐漸成為骨組織工程較理想的種子細(xì)胞[24-25]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞可通過歸巢機(jī)制修復(fù)骨質(zhì)疏松小鼠骨損傷，并可修復(fù)不同病理狀態(tài)下的軟骨損傷，定向分化為成軟骨細(xì)胞，促進(jìn)骨損傷修復(fù)[8-9，26]。

原代脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)主要包括組織塊貼壁法和酶消化法，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)方法所得細(xì)胞形態(tài)一致，生物學(xué)特性穩(wěn)定，均高表達(dá)CD44、Sca-1，弱表達(dá)CD31，在誘導(dǎo)劑作用下，可定向分化為成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞，因此證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞。并且組織塊貼壁法培養(yǎng)所得脂肪干細(xì)胞比膠原酶消化法細(xì)胞增殖更快，表明前者具有更強(qiáng)的增殖能力。

脂肪干細(xì)胞成骨分化的過程大致分為2個階段，首先，脂肪干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，其次，成骨細(xì)胞進(jìn)行增殖并分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)鈣化成骨，全程大約需要2～3周。ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志酶，其促進(jìn)成骨細(xì)胞鈣和磷的沉積。通常認(rèn)為，ALP是成骨細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志物，因而研究中常用該酶的活性體現(xiàn)成骨細(xì)胞的存在和分化程度[27]。成骨細(xì)胞是促進(jìn)骨礦化的主要細(xì)胞，可分泌ALP和鈣鹽結(jié)晶體至細(xì)胞外基質(zhì)，促使基質(zhì)礦化，而礦化則是細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟的表現(xiàn)。因此檢測細(xì)胞外基質(zhì)中ALP活性及鈣離子濃度可間接反應(yīng)脂肪干細(xì)胞成骨分化能力。脂肪干細(xì)胞成骨分化過程受多種因素影響，包括供體因素、實(shí)驗(yàn)因素、生長因子、理化因素等[28]。在本研究中，組織塊貼壁法培養(yǎng)所得脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化15 d后，所形成礦化面積百分比高于膠原酶消化法，其次，ALP活性在組織塊法所得脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化15 d后活性高于膠原酶消化法，細(xì)胞外基質(zhì)中鈣離子濃度亦然。以上結(jié)果均表明，組織塊貼壁法相對膠原酶消化法在脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)分化過程中更具優(yōu)勢。

膠原酶消化法的優(yōu)點(diǎn)是接種細(xì)胞數(shù)可定量，培養(yǎng)細(xì)胞純度高；但其缺點(diǎn)是取材量大、酶對細(xì)胞的損傷不好控制、操作步驟多，影響因素多，耗時長。組織塊貼壁法缺點(diǎn)是分離純度不是很理想，接種細(xì)胞數(shù)不能定量；但其優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)，取材量較酶消化法少，操作簡單，影響因素少，可避免酶對組織細(xì)胞的損害。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究認(rèn)為組織塊貼壁法更適合體外脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化研究。