田露 閔建紅 張帝 龔國(guó)利

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021）

發(fā)酵食品是指利用微生物加工制造而成的一類具有獨(dú)特風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食品，分布廣泛且制造和食用歷史悠久，同時(shí)具有豐富的微生物資源，供研究者探索研究［1］。在過去的20年中，新一代測(cè)序技術(shù)和質(zhì)量分析儀，以及其他新技術(shù)的出現(xiàn)，大大提高了發(fā)酵食品的研究進(jìn)展。高通量測(cè)序等方法的頻繁應(yīng)用，為發(fā)酵食品微生物群落分析作出了巨大貢獻(xiàn)，如干酪、葡萄酒的研究。本文通過宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)對(duì)發(fā)酵食品的分子機(jī)制進(jìn)行了探討；著重關(guān)注微生物的演替貢獻(xiàn)、功能基因及酶資源的挖掘，討論了現(xiàn)有的局限性，以期對(duì)未來食品發(fā)酵研究提供相關(guān)線索。

1 宏組學(xué)技術(shù)

發(fā)酵食品中的微生物是一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)集合，從這個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)中獲取的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝物進(jìn)行的研究稱之為宏組學(xué)。進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代，測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，測(cè)序成本明顯下降，形成了涵蓋宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在內(nèi)的宏組學(xué)技術(shù)，推動(dòng)了對(duì)微生物群落的多樣性、結(jié)構(gòu)及潛在基因功能方面的深入研究。

1.1 宏基因組學(xué)

宏基因組［2］，其最初的含義指的是生態(tài)環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和?，F(xiàn)在，宏基因組指的是特定環(huán)境中細(xì)菌和真菌的遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組學(xué)則是一種不依賴于純培養(yǎng)的基因組分析手段，它是通過收集環(huán)境樣品并提取樣品中的優(yōu)質(zhì)DNA來構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，通過高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析來研究樣品中微生物的一種方法。宏基因組學(xué)方法包括全宏基因組技術(shù)及16S rDNA 片段擴(kuò)增技術(shù)，借助高通量測(cè)序，打破了傳統(tǒng)以培養(yǎng)為主的微生物研究方式，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，具有高效性、準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。目前宏基因組學(xué)技術(shù)正日臻成熟，也形成了比較完善的研究流程，其中 DNA 測(cè)序和數(shù)據(jù)分析是宏基因組學(xué)研究的關(guān)鍵部分。

宏基因組學(xué)研究主要分成兩個(gè)層面，一是分析環(huán)境中特定基因，即通過構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，基于序列篩選或者基于功能篩選分析某種功能基因，并進(jìn)一步對(duì)篩選到的基因進(jìn)行深度測(cè)序；二是針對(duì)環(huán)境中所有DNA進(jìn)行深度測(cè)序，分析該環(huán)境中微生物的組成與相關(guān)功能。這兩方面的相關(guān)分析都依賴于測(cè)序的深度和廣度。宏基因組測(cè)序能夠?qū)﹂_菲爾粒中的低豐度物種進(jìn)行鑒定，表明了其在微生物群落分析中具有更高的分辨率和豐度準(zhǔn)確度［3］。借由宏基因組，得以發(fā)現(xiàn)大量不可培養(yǎng)的微生物，以及認(rèn)知更多新的功能基因或新基因簇，極大地增加了人類對(duì)微生物群落組成、演替及其互相作用的認(rèn)識(shí)。

1.2 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)

就環(huán)境樣品微生物研究而言，基因組學(xué)的手段無法說明微生物基因的表達(dá)量情況，當(dāng)生境或其他因素變化時(shí)，同一微生物個(gè)體的基因表達(dá)也會(huì)由于適應(yīng)環(huán)境出現(xiàn)變化，這時(shí)需結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)，它將生境中全部RNA作為研究對(duì)象，從轉(zhuǎn)錄組水平分析樣本微生物的組成及活性基因表達(dá)情況。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指在某個(gè)特定條件或特定時(shí)空，群落中所有微生物基因轉(zhuǎn)錄本的總和，可用于原位衡量微生物群落宏基因組表達(dá)水平，篩選出高表達(dá)活性功能基因和微生物［4］。以前主要采用基因芯片或微陣列技術(shù)，而隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，生境中的RNA也可以直接利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析。針對(duì)動(dòng)態(tài)表達(dá)的基因，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在群體RNA逆轉(zhuǎn)錄后對(duì)cDNA進(jìn)行測(cè)序。揭示了特定生境因素，特定時(shí)間下微生物基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，并且更易發(fā)現(xiàn)新的基因，這些基因可在某些特定環(huán)境條件下發(fā)揮很大作用［5］。

1.3 宏蛋白質(zhì)組學(xué)

宏蛋白質(zhì)組學(xué)是在特定時(shí)間點(diǎn)對(duì)環(huán)境微生物群的所有蛋白質(zhì)的組成進(jìn)行大規(guī)模鑒定。宏蛋白質(zhì)組技術(shù)分析因蛋白質(zhì)復(fù)雜多樣的特點(diǎn)，因此對(duì)檢測(cè)技術(shù)要求具有高通量、高靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍廣、質(zhì)量估計(jì)精確等特點(diǎn)，而質(zhì)譜分析法是最合適條件的檢測(cè)平臺(tái)。一般而言，宏蛋白質(zhì)組學(xué)依據(jù)宏基因組數(shù)據(jù)，通過質(zhì)譜技術(shù)采集特定環(huán)境條件下微生物種群中全部蛋白質(zhì)信息，探索微生物組成及代謝方式，揭示環(huán)境中蛋白質(zhì)的組成與豐度、蛋白質(zhì)的不同修飾、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，可以認(rèn)識(shí)微生物群落的發(fā)展、種內(nèi)相互關(guān)系、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系等。宏蛋白質(zhì)組的研究方法，其流程一般包括蛋白質(zhì)樣品制備、蛋白分離和蛋白鑒定等。研究策略主要有2 種，一種采用雙向凝膠電泳（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-D PAGE） 結(jié) 合質(zhì)譜（Massspectrometry，MS）技術(shù)，能對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行定性和定量分析；另一種是多重色譜分離與 MS 聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行宏蛋白質(zhì)組分析。目前，宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的研究方法是：2-D PAGE與基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF-MS）聯(lián)用［6］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）［7］。特別是新興起的軌道離子阱（Orbitrap）質(zhì)譜技術(shù)，可利用痕量樣品就可以鑒定蛋白質(zhì)，可以用于環(huán)境樣品中低豐度的蛋白質(zhì)分析檢測(cè)。因此，色譜串聯(lián)質(zhì)譜法有望在宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究中獲得更為廣泛的應(yīng)用［8］。

在近10年中，宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)環(huán)境微生物群落的研究中，從活性污泥、土壤到人類腸道微生物群，對(duì)微生物生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生了許多重要見解［9］。在發(fā)酵食品中仍然有一些蛋白質(zhì)組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)的報(bào)告，如在高酸度醋發(fā)酵過程中的乳酸菌、醋酸菌、巴氏醋酸桿菌［10］、普洱茶固態(tài)發(fā)酵及中國(guó)白酒類等。宏蛋白質(zhì)組學(xué)仍然是發(fā)酵食品中一個(gè)很有前景但尚未充分開發(fā)的領(lǐng)域。

1.4 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)則是對(duì)某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的一門新學(xué)科。研究代謝組可以了解生物體的基因型和表型是如何關(guān)聯(lián)的，以及外界環(huán)境如何對(duì)生物代謝產(chǎn)生影響的。靶向或非靶向代謝組學(xué)分析都依賴于代謝物分離、檢測(cè)、鑒定和定量以及多元數(shù)據(jù)分析［11］。代謝物的分離與檢測(cè)是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟，目前最常用的代謝組學(xué)分析技術(shù)是核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），這些分析方法都可以鑒定代謝物的結(jié)構(gòu)和測(cè)定分子濃度［12-13］。核磁共振技術(shù)樣品預(yù)處理方法簡(jiǎn)單，能夠快速準(zhǔn)確地對(duì)樣品進(jìn)行高通量分析。在乳酸菌代謝組學(xué)測(cè)定分析中應(yīng)用較為廣泛的是GC-MS和LCMS，這兩種技術(shù)可以檢測(cè)包括糖、糖醇、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸及大量次級(jí)代謝物在內(nèi)的數(shù)百種化合物［14］。代謝組學(xué)能高通量的鑒定和定量代謝物的變化［15］。它已成功應(yīng)用于各種發(fā)酵食品中的代謝物概況，以評(píng)估食品質(zhì)量、可追溯性、真實(shí)性和安全性。當(dāng)與其他宏組學(xué)方法相結(jié)合時(shí)，代謝組學(xué)為揭示發(fā)酵食品生產(chǎn)的潛在機(jī)制提供了重要的見解。

2 宏組學(xué)工具在發(fā)酵食品微生物群落研究中的應(yīng)用

2.1 奶酪

奶酪也稱乳酪或干酪，是動(dòng)物乳經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸或凝乳酶使蛋白質(zhì)凝固，并經(jīng)進(jìn)一步成熟而形成的具有不同風(fēng)味的乳制品。奶酪微生物群落包括細(xì)菌、酵母和霉菌等，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)凝固和獨(dú)特風(fēng)味形成過程中發(fā)揮著決定性的作用。

美國(guó)哈佛大學(xué)學(xué)者Wolfe［16］對(duì)10個(gè)國(guó)家的137種奶酪表皮群落進(jìn)行了宏基因組直接測(cè)序，揭示了奶酪表皮中廣泛分布著24種主要的細(xì)菌和真菌。測(cè)序樣本表明這些奶酪中分布的微生物具有高度可重復(fù)性，并將奶酪表皮作為一種模式生態(tài)系統(tǒng)，用來研究微生物之間的相互作用和變化機(jī)制。微生物宏基因組研究及數(shù)據(jù)分析很大程度上依賴于參考菌株數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富度，傳統(tǒng)奶酪發(fā)酵是一個(gè)典型微生物群落作用的結(jié)果，然而，目前對(duì)奶酪發(fā)酵的群落結(jié)構(gòu)、安全性、不同微生物作用等特征的研究還不夠成熟，一個(gè)重要原因就是參考菌株數(shù)據(jù)庫(kù)的缺乏。Almeida等［17］利用測(cè)序技術(shù)建立了奶酪菌群數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其67個(gè)屬中137個(gè)物種的142株菌株進(jìn)行了基因組測(cè)序，并重構(gòu)117個(gè)基因組。其中包括了目前未在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的克呂沃氏菌屬，藤黃球菌屬和海生乳桿菌屬等微生物，這對(duì)乳制品微生物的群落研究起到了重要作用。用這些乳制品基因組作為參考，觀察到傳統(tǒng)奶酪中一些微生物最初并沒有被接種，如假交替單胞菌，或靜止嗜冷桿菌，卻是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌種，對(duì)奶酪產(chǎn)品的特性起作用。宏基因組學(xué)方法應(yīng)用于墨西哥奶酪Cotija微生物群的分類和功能特性中［18］，其中細(xì)菌菌群由約98%的厚壁菌門組成，包括3種優(yōu)勢(shì)菌屬（乳酸桿菌、明串珠菌和魏斯氏菌）以及500多種非優(yōu)勢(shì)屬，分屬細(xì)菌和古細(xì)菌的31個(gè)門。宏基因組數(shù)據(jù)表明，Cotija菌群具有產(chǎn)生特有風(fēng)味和香味化合物的代謝潛能，主要參與支鏈氨基酸和游離脂肪酸代謝。全面解析奶酪樣品中微生物群落多樣性，比較不同種類奶酪樣品微生物群落結(jié)構(gòu)差異，對(duì)解析奶酪蛋白質(zhì)凝固和風(fēng)味質(zhì)構(gòu)形成具有重要的參考價(jià)值。同時(shí)，也為發(fā)掘和分離奶酪中的微生物菌株資源奠定基礎(chǔ)。

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用于發(fā)酵食品是探索各種微生物在發(fā)酵過程中的代謝途徑，并揭示其特定功能和對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)。目前奶酪表皮微生物群落的參考基因組序列較為豐富，為宏轉(zhuǎn)錄組分析奶酪成熟過程中表皮微生物群落提供了更大可能性，奶酪持續(xù)成為發(fā)酵食品微生物研究的熱點(diǎn)對(duì)象。Monnet等［19］分別在第5、14、19和35 d通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了瑞布羅申奶酪（Reblochon）中微生物的活性。另外，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)也可以揭示高溫驅(qū)動(dòng)奶酪成熟過程中微生物群落及其功能的變化［20］，在奶酪成熟過程中，溫度上升顯著提高了奶酪成熟率，并且與蛋白質(zhì)水解、脂類分解、氨基酸或脂質(zhì)分解代謝有關(guān)微生物的基因表達(dá)也發(fā)生了上調(diào)。這些宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，通過調(diào)控溫度進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)微生物的代謝產(chǎn)物的目的。因此，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)優(yōu)化生產(chǎn)效率及提高產(chǎn)品質(zhì)量有重要的指導(dǎo)意義。

隨著組學(xué)技術(shù)的成熟和成本的降低，研究者們正試圖用多種組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合分析來更好地揭示發(fā)酵過程中微生物的功能及其相互作用機(jī)制，以期獲得突破性的研究成果。Dugat-Bony等［21］通過宏基因組學(xué)，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生化分析研究了4周成熟期內(nèi)6種細(xì)菌和3種酵母組成的表面成熟的奶酪群體變化。在成熟初期，乳酸乳球菌和乳酸克魯維酵母迅速消耗乳糖產(chǎn)生大量乳酸。乳酸再被漢遜德巴利酵母和假絲地霉酵母迅速消耗，這表達(dá)了高水平的乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)錄本。大多數(shù)的RNA測(cè)序片段匹配到假絲地霉酵母的基因上，表明該菌對(duì)酪蛋白和脂肪降解起重要作用。測(cè)序數(shù)據(jù)表明與氨基酸降解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本源于假絲地霉酵母、干酪棒桿菌和蜂房哈夫尼亞菌，這一數(shù)據(jù)結(jié)果與假絲地霉酵母、干酪棒桿菌和蜂房哈夫尼亞菌在后期奶酪表皮旺盛生長(zhǎng)相符。在這篇報(bào)道中作者結(jié)合不同的數(shù)據(jù)分析，獲得了奶酪成熟過程中各種微生物的代謝產(chǎn)物及其可能的相互作用機(jī)制。此外，還采用差異表達(dá)分析提供了一組用于監(jiān)測(cè)奶酪制作過程的生物標(biāo)記基因，為監(jiān)控奶酪制作過程提供了有價(jià)值的工具。

2.2 發(fā)酵酒精飲料

發(fā)酵酒精飲料是以糧食、水果等為主要原料通過發(fā)酵或半發(fā)酵手段制成的可食用型飲料酒。研究者利用微生物培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法對(duì)發(fā)酵過程中生產(chǎn)環(huán)境和原料中的各種微生物群落進(jìn)行了研究，如日本的清酒［22］、中國(guó)濃香型酒［23］和葡萄酒［24］等。

在印度米酒酒曲研究中，Bora等［25］首次應(yīng)用宏基因組學(xué)揭示了更為全面的微生物群落特征，其中微生物包括以乳酸菌為主的細(xì)菌、根霉、毛霉和曲霉等產(chǎn)淀粉酶菌株，季也蒙畢赤酵母、威克漢姆西弗酵母、釀酒酵母等產(chǎn)乙醇菌株。但對(duì)于所獲得的宏基因組數(shù)據(jù)，作者僅報(bào)道了分類學(xué)研究結(jié)果，并沒有進(jìn)一步分析功能基因組和其代謝途徑。

微生物群落在酒發(fā)酵過程中扮演著不同的角色，對(duì)酒的發(fā)酵起著至關(guān)重要的作用。研究者們利用宏基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建代謝途徑，能夠?yàn)槲⑸锶郝涞拇x特征提供更加詳細(xì)的解析。例如，在醬香型白酒發(fā)酵過程中，Chen等［26］報(bào)道，宛氏擬青霉具有最高的葡糖淀粉酶活性，米曲霉在可培養(yǎng)的真菌物種中顯示出最高的a-淀粉酶活性。此外，在宛氏擬青霉和米曲霉生長(zhǎng)與堆積發(fā)酵過程中淀粉和還原糖含量變化是一致的，表明它們?cè)谔峁┑矸勖杆獾矸鄯矫姘l(fā)揮著重要作用。在中國(guó)濃香型白酒中，克氏梭菌被認(rèn)為是主要風(fēng)味化合物己酸乙酯前體己酸的主要生產(chǎn)者［27］。在越南米酒的微生物演替和功能特性研究中，根霉被確定為主要的淀粉降解菌，釀酒酵母為主要的乙醇生產(chǎn)者。

釀酒酵母長(zhǎng)期用于制備發(fā)酵酒精飲料和其他發(fā)酵食品，對(duì)其基因組學(xué)進(jìn)行分析有助于研究其在發(fā)酵酒精飲料中的功能和演替特性。有研究者通過宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)從茅臺(tái)酒制造環(huán)境中分離出的釀酒酵母MT1［28］進(jìn)行研究，結(jié)果表明MT1具有獨(dú)特的多碳協(xié)同作用，它可以同時(shí)利用各種糖，包括葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖、海藻糖、棉子糖和松二糖。并且在低濃度葡萄糖存在下，己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT5和HXT13的基因在MT1中的表達(dá)也會(huì)受到抑制。Song等［29］對(duì)酵母研究群體中常用的25種釀酒酵母菌株的基因組進(jìn)行了重新測(cè)定，并開發(fā)了一套自動(dòng)化泛基因組分析。他們還將11種替代釀酒酵母參考菌株的基因組序列和相應(yīng)的注釋整合到酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，為進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)庫(kù)。

宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法在發(fā)酵酒精飲料中也有相關(guān)應(yīng)用，它提高了人們對(duì)發(fā)酵酒精飲料的認(rèn)識(shí)。有研究者對(duì)使用30年和300年的中國(guó)濃香型白酒窖泥采用宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行比較，鑒定出63種差異表達(dá)蛋白；59種蛋白在300年的窖泥種高度表達(dá)［30］，這些蛋白參與甲烷生成，形成己酸和丁酸，因此它們?cè)?00年窖泥發(fā)酵過程中可能有助于產(chǎn)生更多的有機(jī)化合物。

在酒同步糖化發(fā)酵過程中，像絲狀真菌類的微生物能分泌水解酶，使淀粉降解成可發(fā)酵糖，而釀酒酵母使糖轉(zhuǎn)化為乙醇和風(fēng)味物質(zhì)。在茅臺(tái)酒生產(chǎn)中，通過代謝物譜比較和分析，發(fā)現(xiàn)米曲霉不僅為釀酒酵母提供可發(fā)酵糖，而且在糖消耗中與釀酒酵母互相競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致茅臺(tái)酒形成了不同的風(fēng)味成分［31］。白酒易被鏈霉菌屬［Streptomyces（St.）spp.］污染，從而產(chǎn)生土腥素導(dǎo)致白酒帶有泥土味，這是白酒發(fā)酵生產(chǎn)中普遍存在的問題。研究人員從茅臺(tái)大曲中分離出的拮抗芽孢桿菌菌株［32］具有顯著抑制土腥素主要生產(chǎn)者St. sampsoni的生長(zhǎng)，并且在模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中有效地降低了土腥素的產(chǎn)生。最后通過超高相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-ESI/Q-TOF MS）鑒定了芽孢桿菌中的抗菌物質(zhì)為脂肽。這兩項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了基于綜合代謝組學(xué)方法分析白酒發(fā)酵的條件優(yōu)化和生物防治的潛力，可以為中國(guó)白酒的工藝改良和品質(zhì)的提高提供必要的理論依據(jù)和奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

2.3 發(fā)酵蔬菜

發(fā)酵蔬菜種類繁多，如豆瓣醬、泡菜等。在蔬菜起始發(fā)酵和主發(fā)酵階段，占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌包括腸膜狀明串珠菌、短乳桿菌、啤酒片球菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌及糞鏈球菌等，其中乳酸菌是發(fā)酵的主體。近年來，宏組學(xué)方法已應(yīng)用于蔬菜發(fā)酵過程中的微生物群落研究。

泡菜是用蔬菜（卷心菜、韭菜和蘿卜等）和各種香料（紅辣椒粉、大蒜和姜等）混合發(fā)酵制得，有時(shí)添加發(fā)酵劑。泡菜中的代謝物在發(fā)酵或長(zhǎng)期儲(chǔ)存過程中會(huì)發(fā)生變化，這與微生物的演替有關(guān)［33］。核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）分析表明，泡菜發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、甘露醇和γ-氨基丁酸（Gamma- aminobutyric acid，GABA），明串珠菌和沙克乳桿菌分別被確定為甘露醇和GABA的生產(chǎn)者。為了評(píng)價(jià)泡菜中發(fā)酵劑植物乳桿菌的發(fā)酵特性，采用了GC-MS和主成分分析（Principal component analysis，PCA）方法，揭示了植物乳桿菌對(duì)代謝組學(xué)的影響，在發(fā)酵過程中植物乳桿菌引起乳酸和甘油增加，也導(dǎo)致了纈氨酸、亮氨酸、檸檬酸和蔗糖減少［34］。

宏基因組學(xué)方法也應(yīng)用于泡菜中，并有了一定的成果。Jung等［35］運(yùn)用宏基因組學(xué)研究了泡菜29 d發(fā)酵過程中的微生物群落。通過宏基因組的16S rRNA基因數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明泡菜中優(yōu)勢(shì)菌屬為明串珠菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬。在基因功能注釋方面，采用宏基因組注釋技術(shù)，揭示了一系列碳水化合物異型乳酸發(fā)酵的相關(guān)基因，這與檢測(cè)到的發(fā)酵產(chǎn)物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯和乙醇等相一致。大多數(shù)泡菜的宏基因組序列與腸膜明串珠菌和沙克乳桿菌基因有很高的同源性，說明這兩種菌在泡菜發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用。在宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中也鑒定出了大量的噬菌體DNA序列，說明發(fā)酵過程中微生物群落受到了噬菌體感染。這些結(jié)果不僅深入揭示泡菜發(fā)酵中微生物的功能，也揭示了微生物群落對(duì)泡菜發(fā)酵過程的影響。

這些代謝組學(xué)和宏基因組學(xué)報(bào)告使我們更好地認(rèn)識(shí)各種微生物在泡菜發(fā)酵過程中發(fā)揮的重要作用，其結(jié)果有益于提高發(fā)酵蔬菜的質(zhì)量和安全性。

2.4 發(fā)酵茶

發(fā)酵茶因其有益健康而一直深受世界各地人們的喜愛。例如，中國(guó)普洱茶、茯磚茶和泰國(guó)的Miang［36］。普洱茶是一種典型的發(fā)酵茶，它分為生茶和熟茶兩種，是在較高溫度和濕度下加速發(fā)酵制得［37］。Tian 等［38］通過微生物培養(yǎng)和 PCR-DGGE 方法研究了普洱茶生長(zhǎng)和成熟不同時(shí)間段（從＜1-192個(gè)月）樣品中的細(xì)菌和真菌群落。研究結(jié)果表明，普洱茶貯存時(shí)間和質(zhì)量之間的關(guān)系很復(fù)雜，涉及多酚含量、微生物豐度和多樣性變化。真菌和細(xì)菌豐度隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)而降低，且熟茶微生物種類顯著多于生茶。細(xì)菌多樣性與老化時(shí)間呈正相關(guān)，老化前60個(gè)月生茶和熟茶的真菌多樣性增加，隨后下降，這與多酚含量變化有關(guān)。Lyu等［39］通過普洱熟茶發(fā)酵的初步宏基因組學(xué)研究劃定了微生物群落的分類和功能特性，確定了3個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（變形桿菌，放線菌和厚壁菌門）和一個(gè)處于主導(dǎo)地位的真菌門（子囊菌門）。鑒定并分析了涉及16種途徑的69個(gè)酶基因，如萜類化合物和聚酮化合物的代謝以及其他次生代謝物的生物合成。這些宏基因組數(shù)據(jù)表明普洱茶發(fā)酵的主要微生物包含細(xì)菌和酵母，功能基因的挖掘和代謝途徑的分析有利于在分子水平上對(duì)普洱茶發(fā)酵機(jī)理作進(jìn)一步研究。

通過細(xì)菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因的擴(kuò)增子測(cè)序，在普洱茶中鑒定出變形桿菌（48.42%）、厚壁菌門（19.91%）、放線菌（16.91%）和藍(lán)藻（9.95%）為主要細(xì)菌，曲霉菌（94.98%）為主要真菌［40］。通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀或質(zhì)譜儀（LC-MS/ MS）進(jìn)一步對(duì)相同樣品進(jìn)行宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析，確定了至少有兩種獨(dú)特肽的335種蛋白質(zhì)。在曲霉菌中發(fā)現(xiàn)了一半已鑒定的蛋白質(zhì)，這進(jìn)一步說明曲霉是優(yōu)勢(shì)真菌和固態(tài)發(fā)酵的主要貢獻(xiàn)者。鑒定出的蛋白質(zhì)，包括涉及降解植物細(xì)胞壁的酶和過氧化物的氧化還原酶等與普洱茶發(fā)酵密切相關(guān)的酶，以及與兒茶素氧化有關(guān)的過氧化氫酶和過氧化物酶。另外，代謝組學(xué)也被應(yīng)用在發(fā)酵茶揮發(fā)性和非揮發(fā)性化學(xué)成分動(dòng)態(tài)變化的研究中。研究者通過超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS）的非靶向代謝組學(xué)方法分析了紅茶茶樹某品種在發(fā)酵14 h期間代謝產(chǎn)物的變化［41］，并鑒定出61種代謝產(chǎn)物。這項(xiàng)研究提供了紅茶發(fā)酵過程中非揮發(fā)性代謝物變化的綜合概況［42］。

在對(duì)發(fā)酵茶的研究過程中，宏組學(xué)技術(shù)為闡明微生物在發(fā)酵過程中的作用提供了全面而系統(tǒng)的概述。使人們更好地了解了普洱茶發(fā)酵過程中微生物的消亡規(guī)律和其對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響。

2.5 發(fā)酵豆制品

發(fā)酵豆制品主要有兩種，一種是黏性大豆食品，如日本納豆、韓國(guó)chungkookjang；另一種是由絲狀霉菌如曲霉、毛霉和根霉發(fā)酵的咸大豆產(chǎn)品。

各種黏性性大豆制品的黏性是由聚-γ-谷氨酸（Poly-gamma-glutamic acid，PGA）產(chǎn)生，其最主要的細(xì)菌通常是枯草芽孢桿菌［43］，且印度Kinema的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和索諾拉沙漠芽孢桿菌［Bacillus（B.）sonorensis］均產(chǎn)生 PGA［44］。Jung等［45］通過16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序和1H NMR專門研究了韓國(guó)大豆醬發(fā)酵中的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)主要的芽孢桿菌屬和腸球菌屬的豐度與代謝物變化無關(guān)，而四聯(lián)球菌是產(chǎn)生有機(jī)酸和生物胺的主要原因，并且乳桿菌是γ-氨基丁酸的主要生產(chǎn)者。從韓國(guó)chungkookjang中分離出的Bacillussp.LM7抗菌菌株［46］，其分泌的抗菌物質(zhì)具有極高穩(wěn)定性和廣泛抗菌譜。通過LC-MS分析確定該物質(zhì)為4種桿菌霉素D和4種表面活性素類似物的脂肽混合物。

另一個(gè)重要的發(fā)酵豆制品是醬油，工業(yè)上常用曲霉菌發(fā)酵制得。將醬油菌株米曲霉3.042與米曲霉RIB40的基因組測(cè)序比較［47］，分析鑒定了與細(xì)胞生長(zhǎng)、耐鹽性、環(huán)境抗性和風(fēng)味形成相關(guān)的特異性基因，這基因的發(fā)現(xiàn)能夠解釋菌株產(chǎn)生不同風(fēng)味醬油的原因。米曲霉100-8及其親本菌株米曲霉3.042用于醬油發(fā)酵，在30、36和42 h的早期發(fā)酵中通過轉(zhuǎn)錄組和實(shí)時(shí)定量PCR分析比較它們的基因表達(dá)［48］，結(jié)果顯示米曲霉100-8中參與活性氧、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和孢子形成有關(guān)的基因表達(dá)較低，而與糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸代謝和β-氧化相關(guān)的基因表達(dá)較高。這種基因調(diào)控說明在米曲霉100-8發(fā)酵中高活性的酶是參與糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸代謝和β-氧化相關(guān)的酶。除真菌外，16S rRNA基因的DGGE和1H NMR代謝物分析鑒定出色鹽桿菌在韓國(guó)醬油發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸和腐胺。在對(duì)醬油鹵水發(fā)酵過程中微生物演替及其功能的研究中，Sulaiman等［49］通過宏基因組研究傳統(tǒng)醬油發(fā)酵過程的微生物群落演替和基因功能，并分析了優(yōu)勢(shì)菌群代謝與鹵水特性變化的關(guān)聯(lián)。該研究發(fā)現(xiàn)在6個(gè)月的發(fā)酵過程中，中國(guó)醬油鹵水是先以魏斯氏菌屬為主，后由真菌念珠菌屬發(fā)酵制得。通過宏基因組序列的代謝重建，揭示了蛋白質(zhì)和碳水化合物異型發(fā)酵的特征，與檢測(cè)到乙醇和pH值下降相符。這些研究深入剖析了豆制品發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)以及多種優(yōu)勢(shì)微生物的基因組和代謝途徑特性，為今后豆制品優(yōu)質(zhì)發(fā)酵提供了有效的依據(jù)。

2.6 食醋

食醋是由含糖底物發(fā)酵產(chǎn)生的傳統(tǒng)醋酸產(chǎn)品。其品質(zhì)取決于多種因素，包括酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段的原料和微生物多樣性［50］。目前，許多微生物學(xué)研究已揭示了傳統(tǒng)發(fā)酵食醋釀造過程中微生物群落的多樣性和形成規(guī)律，但是對(duì)群落中微生物的相互作用及主要代謝產(chǎn)物形成之間的關(guān)系仍不清楚。基于宏基因組測(cè)序分析等技術(shù)的應(yīng)用是有效解決上述問題的重要手段。

谷物酸固態(tài)醋酸發(fā)酵是一種混合培養(yǎng)發(fā)酵過程［51］。研究者發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)江香醋的細(xì)菌群落演替和風(fēng)味形成相關(guān)［52］，其主要風(fēng)味物質(zhì)是通過在群落中微生物的代謝和相互作用而產(chǎn)生。通過rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序和風(fēng)味分析發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)江香醋在18 d發(fā)酵過程中產(chǎn)生風(fēng)味的核心微生物主要有醋酸桿菌、乳桿菌、曲霉菌和交鏈孢霉［53］。同時(shí)應(yīng)用雙向正交偏最小二乘法（Bidirectional orthogonal partial least squares，O2PLS）的微生物演替與風(fēng)味動(dòng)力學(xué)相關(guān)性分析強(qiáng)調(diào)了細(xì)菌的重要性。根據(jù)其在微生物群落中的主導(dǎo)地位和功能，建議將醋酸桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、乳酸球菌、葡萄糖酸桿菌、芽孢桿菌和葡萄球菌7個(gè)屬作為食醋風(fēng)味的功能性核心菌群。通過宏組學(xué)技術(shù)研究微生物在食醋發(fā)酵中的功能可能有助于弄清其代謝所產(chǎn)生的益處，提高食醋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3 總結(jié)與展望

如上所述，近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，以其為主要手段的宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白質(zhì)組等技術(shù)在大量的食品微生物中應(yīng)用，對(duì)食品微生物的研究方法和研究?jī)?nèi)容產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。然而，目前的宏組學(xué)分析仍存在一些局限性。例如，宏基因組技術(shù)依賴于總DNA提取與測(cè)序深度。天然環(huán)境復(fù)雜多樣，環(huán)境中的核酸酶及腐殖質(zhì)都會(huì)影響總DNA提取，因此需要根據(jù)不同環(huán)境樣品優(yōu)化提取條件與提取方法?，F(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)如Illumin適用高通量測(cè)序，但是序列片段短，拼接具有一定難度；宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)也存在許多技術(shù)上的挑戰(zhàn)，如mRNA半衰期短、富集非常困難、cDNA合成和擴(kuò)增存在偏差等；宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)量較大，測(cè)序數(shù)據(jù)的后續(xù)分析也依賴于硬件系統(tǒng)與算法程序的精確性，因此后續(xù)數(shù)據(jù)處理結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于硬件系統(tǒng)和算法程序的開發(fā)。另外，由于測(cè)序費(fèi)用昂貴導(dǎo)致測(cè)序重復(fù)樣本較少，降低了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和再現(xiàn)性；宏蛋白質(zhì)組學(xué)在研究環(huán)境中微生物區(qū)系的活動(dòng)中具有很大潛力，但是環(huán)境樣品（如土壤和沉積物等）成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)提取是該技術(shù)最大挑戰(zhàn)，而且蛋白質(zhì)不能擴(kuò)增，穩(wěn)定性差，環(huán)境中蛋白質(zhì)含量少等因素，影響提取效果與提取效率。

隨著宏組學(xué)技術(shù)提取方法的改進(jìn)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，相信這些技術(shù)的缺點(diǎn)將會(huì)逐漸被解決，并在多種生態(tài)領(lǐng)域得到快速的發(fā)展和應(yīng)用。目前，具有更多優(yōu)勢(shì)的三代測(cè)序技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)運(yùn)而生，如太平洋測(cè)序生物科學(xué)公司Pac Bio RS平臺(tái)具有超長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度（10 kb）和極低的鳥嘌呤核酸和胞嘧啶核酸（Guanylic acid andcytidylic acid，GC）偏好性，有利于基因組的組裝［54］；在高等動(dòng)植物基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究中測(cè)序技術(shù)和光學(xué)圖譜技術(shù)的結(jié)合使用，為發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)的研究提供了更加準(zhǔn)確的方法。隨著測(cè)序、MS技術(shù)的進(jìn)步和統(tǒng)計(jì)算法軟件快速的更新?lián)Q代，相信包括宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝學(xué)在內(nèi)的綜合宏組學(xué)技術(shù)的聯(lián)系將會(huì)更加緊密。宏基因組學(xué)提供環(huán)境總DNA信息，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供環(huán)境總RNA信息，宏蛋白質(zhì)組學(xué)提供實(shí)時(shí)狀況下環(huán)境功能信息，代謝組學(xué)提供環(huán)境代謝產(chǎn)物的總體信息。將這些“組學(xué)”有效地結(jié)合起來并用于研究復(fù)雜的發(fā)酵食品體系中的微生物資源，可使人們從系統(tǒng)角度全面認(rèn)識(shí)微生物群落與其功能，利用其規(guī)律、挖掘新的微生物菌種及其酶資源等，這將是未來微生物生態(tài)學(xué)研究的新趨勢(shì)。