陶萬(wàn)銀, 朱 書(shū)

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部 中科院天然免疫與慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心分子醫(yī)學(xué)部， 合肥 230026 )

腸道微生物對(duì)疾病和健康的影響越來(lái)越受到人們的重視。腸道中生活著包括原核生物細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物真菌、原生動(dòng)物以及無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病毒等多種微生物。當(dāng)前對(duì)腸道微生物的研究以腸道細(xì)菌為主，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到包括多種自身免疫性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療都與腸道菌群有關(guān)[1]。病毒是指沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，依賴宿主細(xì)胞完成復(fù)制的一類(lèi)生物。起先病毒是作為“致病因子”被發(fā)現(xiàn)的，也是導(dǎo)致許多重要人類(lèi)疾病的病原體，如人類(lèi)天花、流感、艾滋病及病毒性肝炎等多種傳染病的致病原都是病毒。近年來(lái)隨著深度測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到在健康人體中也存在大量的病毒。根據(jù)宿主不同，腸道病毒組包括真核DNA和RNA病毒，原核生物(包括細(xì)菌和古細(xì)菌)噬菌體，人類(lèi)基因組中的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件(Endogenous retrovirus elements)等[2-3]。腸道病毒與人體免疫及疾病的關(guān)系也越來(lái)越受到重視，已經(jīng)報(bào)道了包括炎性腸炎、腸癌、腸道感染等多種疾病的發(fā)生與腸道病毒相關(guān)[2-3]。

1 腸道病毒組的演化和穩(wěn)態(tài)

腸道病毒包括內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件；感染人類(lèi)、腸道中的小型真核細(xì)胞，或者是作為食物來(lái)源的動(dòng)物，植物的真核病毒；以及感染細(xì)菌的病毒，即噬菌體。根據(jù)形態(tài)觀察正常糞便包含病毒樣顆粒約108～109/g，其中絕大多數(shù)是噬菌體[4]。在出生后的最初幾年中，由噬菌體和真核生物RNA和DNA病毒組成的病毒微生物組處于快速演化的狀態(tài)，而成年后整體上是相對(duì)穩(wěn)定的[5-6]。關(guān)于人類(lèi)在胎盤(pán)中是否會(huì)接觸到微生物還有爭(zhēng)議，一般認(rèn)為排除感染因素正常胎盤(pán)中不含有可檢測(cè)到的微生物，腸道細(xì)菌是在出生后迅速獲得[7]。Lim等研究了健康嬰兒雙胞胎的縱向隊(duì)列中腸道病毒組和細(xì)菌微生物組，發(fā)現(xiàn)病毒組和細(xì)菌微生物組在同卵雙胞胎之間比在不相關(guān)的嬰兒之間更相似。從出生到2歲階段，腸道真核病毒組和細(xì)菌微生物組擴(kuò)大，相反，噬菌體病毒體組減少。噬菌體-細(xì)菌的關(guān)系呈動(dòng)態(tài)變化，符合lotka-volterra捕食模型[8-9]。這一研究展示了嬰兒微生物群具有高度的動(dòng)態(tài)性，并且細(xì)菌、病毒和噬菌體的組成與年齡的變化有關(guān)[5]。

在成人中觀察到微生物組相對(duì)穩(wěn)定，并且宏基因組分析顯示每個(gè)人的微生物組成都是獨(dú)特的。Minot等通過(guò)宏基因組測(cè)序分析了一個(gè)成年個(gè)體超過(guò)2.5 年的病毒群落。在整個(gè)2.5年的研究期間腸道病毒組有80%持續(xù)存在，表明其長(zhǎng)期的總體穩(wěn)定性，而基因組的變異速率因病毒類(lèi)型而異[6]。溫和噬菌體(Temperate phages)的突變率相對(duì)較低，這與其在整合原噬菌體狀態(tài)中通過(guò)細(xì)菌DNA聚合酶的精確復(fù)制有關(guān)。相反，單鏈環(huán)狀DNA基因組的裂解性噬菌體Microviridae顯示出高變異率(每天每個(gè)核苷酸 >10-5)，因此在該研究的2.5年期間累積的序列差異足以產(chǎn)生新的病毒株。由此可見(jiàn)，人類(lèi)腸道病毒的多樣性源于兩個(gè)來(lái)源，即一小部分病毒在腸道內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定存在，而另一部分來(lái)源于病毒的長(zhǎng)期迅速進(jìn)化[6]。

在宿主免疫狀態(tài)發(fā)生變化時(shí)，會(huì)引發(fā)腸道病毒組也發(fā)生變化。一些病毒呈潛伏狀態(tài)，在特定情況下會(huì)被重新激活。Reese等發(fā)現(xiàn)蠕蟲(chóng)感染小鼠后，會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生白細(xì)胞介素-4(IL-4)和轉(zhuǎn)錄因子Stat6的激活，在體內(nèi)重新激活鼠γ皰疹病毒(γ-herpesvirus)感染。IL-4通過(guò)誘導(dǎo)Stat6與重要的病毒轉(zhuǎn)錄激活因子的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)病毒復(fù)制并阻斷宿主干擾素-γ(IFNγ)的抗病毒作用，表明處于潛伏狀態(tài)的病毒已進(jìn)化出了感知宿主免疫狀態(tài)的機(jī)制[10]。類(lèi)似的，蠕蟲(chóng)感染也會(huì)增強(qiáng)宿主對(duì)諾如病毒的易感性[11]。HIV感染后降低CD4+T細(xì)胞數(shù)量，削弱了機(jī)體免疫力[12]。Monaco等人對(duì)烏干達(dá)HIV感染患者的腸道病毒組和細(xì)菌微生物組進(jìn)行了表征，分析比較了健康對(duì)照組，未治療的HIV感染患者以及用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(ART)治療的HIV患者等人群的腸道病毒組和細(xì)菌微生物組，發(fā)現(xiàn)外周CD4+T細(xì)胞數(shù)量降低與腸道腺病毒擴(kuò)增相關(guān)，并且這種增加與是否接受ART治療無(wú)關(guān)。此外，CD4+T細(xì)胞數(shù)量較低的患者的腸道細(xì)菌多樣性和豐富性降低，而一些特定的細(xì)菌豐度也發(fā)生變化，比如與炎癥相關(guān)的腸桿菌科細(xì)菌的增加。因此，進(jìn)行性HIV感染的免疫缺陷與腸道病毒組和細(xì)菌微生物組的改變有關(guān)，這一研究可能有助于認(rèn)識(shí)和治療AIDS相關(guān)的腸道疾病[13]。

2 病毒組介導(dǎo)腸道中的“跨界”相互作用

腸道病毒與腸道細(xì)菌、腸道中的真核生物和宿主細(xì)胞相互作用。這些復(fù)雜的原核生物和真核生物的“跨界”相互作用對(duì)人體的健康和疾病有著重要影響[14]。腸道病毒組包含能夠感染各種真核或原核宿主的多種病毒，對(duì)介導(dǎo)“跨界”相互作用有著重要影響。真核病毒能夠直接影響宿主免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致一些看似無(wú)害的病毒也可能引起疾病。呼腸孤病毒(Reovirus)經(jīng)常感染人和小鼠，盡管感染后沒(méi)有明顯癥狀，但會(huì)破壞宿主對(duì)食物抗原的耐受，導(dǎo)致乳糜瀉(Celiac disease，CeD)。這是由于呼腸孤病毒感染抑制外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(pTreg)轉(zhuǎn)化，并且促進(jìn)TH1細(xì)胞對(duì)膳食抗原的免疫應(yīng)答，打破了腸道對(duì)食物抗原耐受，從而引發(fā)乳糜瀉的發(fā)展[15]。

噬菌體能夠增強(qiáng)細(xì)菌毒力，間接影響人體健康。伴隨著細(xì)菌感染，噬菌體也大量出現(xiàn)在細(xì)菌感染部位。Sweere等分析了銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和它產(chǎn)生的絲狀噬菌體Pf對(duì)細(xì)菌感染的影響，發(fā)現(xiàn)Pf噬菌體促進(jìn)了銅綠假單胞菌在人的傷口感染。在小鼠模型中，當(dāng)Pf噬菌體存在時(shí)，銅綠假單胞菌的在傷口的感染能力提高了50倍[16]。Pf噬菌體是單鏈DNA病毒，小鼠或人白細(xì)胞內(nèi)吞后產(chǎn)生Pf噬菌體RNA，并觸發(fā)TLR3-TRIF信號(hào)通路誘導(dǎo)I型干擾素IFNβ的產(chǎn)生，抑制腫瘤壞死因子(TNF)通路和宿主免疫細(xì)胞的吞噬作用。相應(yīng)地，針對(duì)Pf的疫苗免疫后可防止小鼠銅綠假單胞菌傷口感染，表明針對(duì)病原相關(guān)噬菌體的疫苗接種也可能作為預(yù)防細(xì)菌感染的潛在策略[16]。

噬菌體也能夠激活宿主腸道免疫信號(hào)通路。對(duì)在CD和UC患者的腸道病毒組深入分析顯示，CD和UC與有尾目噬菌體(Caudovirales)的顯著擴(kuò)增有關(guān)，并且腸道病毒體的擴(kuò)增和多樣化可能并非是細(xì)菌群體的變化結(jié)果，而是導(dǎo)致其發(fā)生變化的原因[17]。Duerkop等從患有IBD的人類(lèi)患者中分離出4株Caudovirales噬菌體用于抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)以治療腸道腫瘤，在結(jié)直腸癌的小鼠模型中能夠有效抑制腸腫瘤生長(zhǎng)，顯示出了很好的效果。分析顯示，這些噬菌體通過(guò)TLR9依賴的干擾素應(yīng)答通路激活腸道的免疫反應(yīng)，引起小腸組織中幾種促炎基因上調(diào)，也促進(jìn)了腸道派氏結(jié)(Peyer′s patches)中CD4+和CD8+T細(xì)胞群的擴(kuò)增。用純化的噬菌體處理葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠，會(huì)加重炎性腸炎癥狀[18]。這一發(fā)現(xiàn)給出了腸道噬菌體影響宿主免疫的直接證據(jù)。

病毒有可能會(huì)編碼調(diào)控宿主代謝等功能的多肽，調(diào)節(jié)宿主功能。 Altindis等通過(guò)搜索美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的病毒/類(lèi)病毒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，在病毒基因組中尋找和62種人體肽激素、代謝相關(guān)細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子等具有同源性的肽序列的存在。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒攜帶與幾種人類(lèi)肽激素具有顯著同源性的序列，包括胰島素，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1和-2，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-19和-21，內(nèi)皮素-1(endothelin-1)，抑制素(inhibin)，脂聯(lián)素(adiponectin)和抵抗素(resistin)等。人工合成的病毒類(lèi)胰島素樣多肽(VILP)能夠與人或小鼠胰島素受體或IGF1受體結(jié)合，刺激受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，增加葡萄糖攝取，并激活細(xì)胞增殖。向小鼠靜脈注射VILP可顯著降低血糖，表明其在體內(nèi)有活性[19]。

3 腸道病毒組與結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)的發(fā)病與腸道微生物有關(guān)，結(jié)直腸癌患者與健康個(gè)體的腸道微生物組不同，包括腸道菌群[20]、腸道真菌[21]和腸道病毒等[22-23]。與健康對(duì)照組相比，結(jié)直腸癌患者腸道噬菌體群落的多樣性顯著增加。進(jìn)一步臨床亞組分析表明，腸道病毒組的失調(diào)與結(jié)直腸癌的進(jìn)程有關(guān)，有20種以上的病毒屬在患有結(jié)直腸癌的受試者和健康對(duì)照者之間有區(qū)別[22]。Hannigan等在結(jié)直腸癌患者糞便樣本中鑒定出組成發(fā)生改變的病毒，主要是來(lái)自Siphoviridae和Myoviridae家族的噬菌體[23]。已經(jīng)有多項(xiàng)研究報(bào)道了腸道細(xì)菌促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[24-25]，有可能腸道病毒組通過(guò)改變宿主細(xì)菌來(lái)間接影響癌癥進(jìn)展[23]。至于腸道病毒是否以及如何直接影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展還有待進(jìn)一步深入研究。

4 腸道病毒組與糞菌移植

通過(guò)糞菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)的方法恢復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)已經(jīng)開(kāi)展了大量臨床實(shí)驗(yàn)，對(duì)多種疾病顯示出了不錯(cuò)的效果[26]。在評(píng)估糞菌移植的治療效果和安全性時(shí)也需要重視腸道病毒在其中可能發(fā)揮的作用。一般認(rèn)為FMT的治療效果主要是恢復(fù)腸道菌群的多樣性和穩(wěn)態(tài)來(lái)達(dá)到治療效果?？紤]到腸道病毒組和菌群的相互作用及其對(duì)宿主的影響，腸道病毒組可能對(duì)糞菌移植的預(yù)后也會(huì)有影響。耐藥性艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)在采用FMT治療后治愈率達(dá)到85%～90%[27-28]。通過(guò)對(duì)CDI患者腸道病毒組測(cè)序分析，Zuo等發(fā)現(xiàn)CDI感染患者腸道病毒組多樣性也發(fā)生了顯著變化。與健康對(duì)照組相比，CDI的受試者表現(xiàn)出明顯較高的有尾噬菌體(Caudovirales)豐度和較低的有尾噬菌體多樣性和均勻性。糞菌移植治療導(dǎo)致CDI中有尾噬菌體的數(shù)量顯著減少。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，移植后供者來(lái)源的有尾噬菌體占受者腸道病毒組的比例與治療效果呈正相關(guān)，提示在CDI糞菌移植治療中腸道有尾噬菌體可能發(fā)揮了作用[29]。而噬菌體能夠增強(qiáng)細(xì)菌感染毒力的發(fā)現(xiàn)也為糞菌移植的臨床安全性提出了警示[16]，即需要評(píng)估可能由腸道病毒引發(fā)的安全隱患。

5 展望

盡管腸道病毒組的重要性受到越來(lái)越多的重視，但目前的研究還很不充分，尚有大量科學(xué)問(wèn)題亟待解決。

首先，需要加強(qiáng)腸道病毒組與疾病的相關(guān)性研究，更充分地認(rèn)識(shí)腸道病毒組的動(dòng)態(tài)變化?；仡欉^(guò)去十多年在腸道微生物研究中取得的成績(jī)，可以看到以16S rDNA深度測(cè)序?yàn)榇淼募夹g(shù)進(jìn)步，能夠不依賴體外培養(yǎng)快速低成本地鑒定腸道菌群的組成，極大地促進(jìn)了細(xì)菌微生物組研究的快速發(fā)展[30]。而全面鑒定腸道中病毒的研究目前還存在許多困難，一是病毒的多樣性和序列高度變異性；二是病毒核酸所占比例較小，在純化和擴(kuò)增病毒相關(guān)序列時(shí)很容易引入額外偏差；三是目前的建庫(kù)和測(cè)序方法在檢測(cè)RNA病毒方面尤其不足，而RNA病毒對(duì)人體健康有重要影響[31]。此外，測(cè)序得到的有可能是全新的病毒，其序列無(wú)法和數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知病毒匹配[32]，因此病毒數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)也需要加強(qiáng)，匯總收錄更多的病毒序列信息。不斷改進(jìn)的建庫(kù)、測(cè)序、分析方法和病毒數(shù)據(jù)庫(kù)將有助于我們更好地認(rèn)識(shí)腸道病毒在其他疾病中可能發(fā)揮的作用。

其次，需要加強(qiáng)對(duì)腸道病毒組的功能研究。腸道細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，據(jù)估計(jì)人類(lèi)腸道中超過(guò)70%的細(xì)菌可以通過(guò)不同條件的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，為進(jìn)一步研究腸道微生物功能奠定了基礎(chǔ)[33-35]。目前可以針對(duì)某一類(lèi)宿主篩選病毒，比如針對(duì)艱難梭菌感染篩選得到的裂解性噬菌體有望用于耐藥菌的治療[36]。不過(guò)考慮到病毒感染的宿主特異性，大規(guī)模培養(yǎng)病毒更加困難，目前還沒(méi)有對(duì)病毒進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的報(bào)道。Yang等利用利巴韋林等廣譜抗病毒成分(Anti-virus component，AVC)清除腸道病毒，研究干擾腸道病毒后對(duì)宿主的影響[37]。不過(guò)這種方法缺少特異性，不足以確定具體是哪種病毒發(fā)揮了作用。值得注意的是，目前研究中廣泛使用的SPF小鼠缺少自然環(huán)境下的共生的腸道菌群和腸道病毒，導(dǎo)致SPF小鼠有著與自然狀態(tài)下不同的免疫反應(yīng)[38]。今后的研究中應(yīng)當(dāng)充分考慮不同腸道菌群和腸道病毒對(duì)宿主的影響。

隨著大規(guī)模測(cè)序數(shù)據(jù)的大量積累，通過(guò)生物信息學(xué)方法從數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘新病毒信息，并且尋找特定功能基因的策略將發(fā)揮重要作用。隨著已經(jīng)解析結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)量不斷積累，通過(guò)人工智能方法根據(jù)氨基酸序列來(lái)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確率不斷提高[39]，使得根據(jù)蛋白相似性預(yù)測(cè)病毒-宿主間的相互作用關(guān)系成為可能。Lasso等開(kāi)發(fā)了一個(gè)計(jì)算框架，基于結(jié)構(gòu)的相似性來(lái)預(yù)測(cè)病原體-宿主相互作用(P-HIPSTer)，根據(jù)結(jié)構(gòu)信息預(yù)測(cè)2.82萬(wàn)例病毒蛋白和人類(lèi)蛋白相互作用，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證率為76%，顯示了很高的準(zhǔn)確率[40]。這一方法也有一系列新的發(fā)現(xiàn)，比如通過(guò)預(yù)測(cè)蛋白-蛋白相互作用來(lái)區(qū)分具有高或低致癌潛力的人乳頭瘤病毒(HPV)[40]，也為研究難以培養(yǎng)的病毒功能提供了思路。

在現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展的早期階段，許多重大發(fā)現(xiàn)都是基于噬菌體研究獲得的。病毒學(xué)研究還發(fā)展出許多強(qiáng)有力的研究工具，大大推動(dòng)了生物學(xué)的研究發(fā)展。比如2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)一半授予了美國(guó)科學(xué)家G.P.Smith和英國(guó)科學(xué)家G.P.Winter爵士，以表彰其“用于肽和抗體的噬菌體展示”。作為細(xì)菌抗病毒免疫反應(yīng)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，為基因操作提供了強(qiáng)有力的工具[41]。對(duì)腸道病毒組的進(jìn)一步深入研究，或許也能給我們帶來(lái)意想不到的驚喜。