孫月彤，李洪艷，鄒偉

遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116081

干細(xì)胞是一類具有自我更新能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下可以分化成多種功能細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是神經(jīng)系統(tǒng)中恒定存在的可進(jìn)行自我更新及多向分化的原始細(xì)胞，可以分化為神經(jīng)元和多種膠質(zhì)細(xì)胞。近年來，越來越多的研究關(guān)注于NSCs 且取得了許多新的進(jìn)展，而對(duì)NSCs 移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的研究也愈發(fā)深入。然而，NSCs 的增殖與分化能力會(huì)逐漸衰退，這成為制約NSCs 體外擴(kuò)增的問題之一。從分裂新生到衰老死亡是細(xì)胞的必經(jīng)歷程，NSCs 也無法避免，這也成為NSCs 臨床應(yīng)用的瓶頸。本文簡(jiǎn)要綜述了NSCs 自我更新與衰老機(jī)制的基礎(chǔ)，旨在為NSCs 臨床應(yīng)用及干細(xì)胞組織工程研究提供理論依據(jù)。

1 NSCs 的發(fā)現(xiàn)及其在腦組織內(nèi)的分布

Reynolds 和Richards 于1992 年首 次 從成年 鼠的紋狀體和海馬中分離出一種可以自我更新并具有多向分化潛能的細(xì)胞群落，命名為NSCs[1]。目前認(rèn)為NSCs 主要存在于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其胚胎時(shí)期，NSCs 存在于大部分腦區(qū)，如皮質(zhì)、嗅球、紋狀體、海馬、脊髓等[2-3]。也有研究表明，人類胚胎的室管膜下區(qū)、海馬、嗅球均有NSCs 存在，近年發(fā)現(xiàn)成人海馬、嗅球、室管膜下區(qū)等腦區(qū)域內(nèi)都存內(nèi)源性NSCs 或前體細(xì)胞[4]。

2 NSCs 的自我更新

干細(xì)胞的特征是具有極強(qiáng)的自我更新能力并可分化為多種類細(xì)胞。干細(xì)胞能夠通過2 種分裂方式來維持自我更新，即對(duì)稱分裂和不對(duì)稱分裂[5]，NSCs 作為干細(xì)胞的一個(gè)重要分類也具有這2 種分裂方式。1 個(gè)NSCs 分裂為2 個(gè)NSCs 或2 個(gè)神經(jīng)祖細(xì)胞（neural progenitor cells，NPCs）為對(duì)稱分 裂，1 個(gè)NSCs分裂為1 個(gè)NSCs 和1 個(gè)NPCs 或1個(gè)NSCs 和1 個(gè)凋亡細(xì)胞為不對(duì)稱分裂[6-7]。值得注意的是，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，NSCs 先通過對(duì)稱分裂進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)歷不對(duì)稱的神經(jīng)源性分裂，即其中一個(gè)子細(xì)胞仍然是一個(gè)增殖性的NPCs，而另一個(gè)子細(xì)胞經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)輪回?cái)U(kuò)增分裂后最終分化，一旦NSCs 完成了不對(duì)稱的神經(jīng)源性分裂，它們通常會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡或進(jìn)入衰老狀態(tài)并減少增殖[8]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 和Notch 信 號(hào)通路在控制干細(xì)胞增殖和分化中起關(guān)鍵作用。Chen 等[9]曾報(bào)道，缺氧缺血后氧化亞硝酸鹽生成并增加了β-catenin 的核內(nèi)積累，同時(shí)激活NSCs的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，發(fā)揮其促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用。而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的過表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)體外hESC-NSC 的生長[10]。此外還發(fā)現(xiàn)[11]，NSCs 的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在3%的低氧培養(yǎng)條件下被進(jìn)一步激活并縮短了細(xì)胞周期，從而促進(jìn)了NSCs 的增殖。這說明神經(jīng)系統(tǒng)處于不利條件時(shí)，能夠提升NSCs 的干 性，增 強(qiáng)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的表達(dá)，促進(jìn)NSCs 的增殖及分化，并抵抗神經(jīng)損傷進(jìn)行自我修復(fù)。在基因水平上，microRNA 也參與了Wnt/β-catenin 通路的調(diào)節(jié)。研究表明，miR-124可以抑制β連環(huán)蛋白抑制基因1（dishevelled binding antagonist of beta catenin 1，DACT1）的表達(dá)并刺激Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而促進(jìn)NSCs的增殖及分化[12]。但與miR-124 的正向促進(jìn)作用不同，miR-148b 能夠抑制Wnt/β-catenin 通路的表達(dá)。腦損傷后的miR-148b 過表達(dá)會(huì)抑制Wnt/βcatenin 通路的傳導(dǎo)和周期蛋白D1 的表達(dá)，減弱神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[13]，而Notch 信號(hào)通路的激活或抑制也被證明決定了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[14]。研究表明，NSCs 中miR-124 的過度表達(dá)可抑制Notch 配體DLL4 的表達(dá)而使Notch 信號(hào)通路失活，并以此促進(jìn)NSCs 增殖及神經(jīng)分化[15]。但出現(xiàn)腦損傷后，某些治療藥物對(duì)NSCs 的促增殖作用是通過上調(diào)Notch 信號(hào)通路，促進(jìn)CDK4、周期蛋白D1、NICD、Hes1 的表達(dá)，而這種激活作用受自我更新相關(guān)基因Notch1 和HES1 的調(diào)節(jié)[16-17]。

3 NSCs 的自噬和凋亡

自噬是真核生物中普遍存在的一種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，是指吞噬自身內(nèi)容蛋白或細(xì)胞器后包入囊泡并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，從而降解所包裹的內(nèi)容物的過程[18]。正常機(jī)體內(nèi)的大多數(shù)干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)且壽命很長。靜息狀態(tài)下，干細(xì)胞清除廢物和衰老細(xì)胞器的能力有限，且為了完成分化需要對(duì)自身進(jìn)行重塑，因此比其他類型的細(xì)胞更需要自噬的調(diào)節(jié)[19]。雖然自噬在維持NSCs 穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，但過度自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的自我消除。K+通道是一類廣泛分布于細(xì)胞膜上且亞型眾多的離子通道，不同類型的K+通道可以通過激活A(yù)kt/mTOR 或AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞的自噬[20]。Chung 等用GFP-LC3 表達(dá)質(zhì)粒對(duì)NSCs 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)自噬蛋白LC3-II、Beclin-1 表達(dá)水平上調(diào)能夠促進(jìn)NSCs 的過度自噬[21]。雖然過度自噬會(huì)導(dǎo)致NSCs 的自我消除，但令人驚奇的是，在進(jìn)行神經(jīng)分化時(shí)，自噬能夠促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化。Pablo 等[22]發(fā)現(xiàn)，在NSCs 向神經(jīng)元分化的過程中，神經(jīng)源性標(biāo)記物Ngn1（神經(jīng)源蛋白1）、NeuroD（神經(jīng)源性分化蛋白）、β-III-tubulin（微管蛋白）明顯上調(diào)，同時(shí)自噬相關(guān)基因Atg7、Becn1、Ambra1 和LC3 同步上調(diào)，該結(jié)果證明了自噬參與NSCs 向神經(jīng)元分化的過程。自噬對(duì)NSCs而言是一把雙刃劍，倘若能夠人為地對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)，就可以有效調(diào)控NSCs 的分化和衰老進(jìn)程。

細(xì)胞凋亡也對(duì)NSCs 的功能有著重要影響。許多研究表明，細(xì)胞凋亡蛋白酶（caspase）在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中起重要作用。Yuan 等發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸通過上調(diào)Bax 和caspase-3 和下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)來促進(jìn)NSCs 的凋亡，其機(jī)制與JNK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[23]。Zou 等[24]觀察到異丙酚能夠通過內(nèi)源性和外源性2 種途徑誘導(dǎo)小鼠胚胎NSCs 的凋亡，且2 種凋亡途徑間存在相互作用，即由外源性途徑激活的caspase-8 裂解產(chǎn)生tBid（細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白），tBid 由胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體膜上刺激細(xì)胞色素C 的釋放，并與胞漿蛋白APAF-1 激活caspase-9，加強(qiáng)外源性途徑的凋亡效應(yīng)。由此可見，多種caspase的激活及凋亡相關(guān)蛋白的釋放可加速細(xì)胞凋亡。Wan 等[25]發(fā) 現(xiàn)，NSCs 經(jīng)p38-shRNA轉(zhuǎn)染并經(jīng)TNFα處理后會(huì)增加Bax 和caspase-3 等促凋亡分子的分泌，降低抗凋亡分子Bcl-2 的表達(dá)，從而加速NSCs 的凋亡，但是通過靶向抑制p38-MAPK 通路則可逆轉(zhuǎn)TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這表明TNFα與MAPK 在NSCs 中的相互作用。以上結(jié)果也說明，與正常細(xì)胞相比，NSC 中的caspase 可與p38- MAPK 或JNK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同調(diào)控細(xì)胞凋亡。

4 NSCs 的衰老

雖然NSCs 具有多項(xiàng)分化潛能和極強(qiáng)的自我更新能力，但同機(jī)體的衰老一樣，NSCs 也會(huì)逐漸衰老并喪失干性，而其細(xì)胞活力和增殖能力取決于端粒酶活性及端粒的損耗程度。Ferrón 等[26]從缺乏端粒酶RNA 成分的小鼠體內(nèi)分離成體及胚胎NSCs 進(jìn)行體外增殖，發(fā)現(xiàn)在缺少端粒酶活性的情況下，端粒受到侵蝕且p53 蛋白表達(dá)水平增加，最終導(dǎo)致成體NSCs 喪失增殖能力；而胚胎NSCs在端粒縮短和核p53 蛋白表達(dá)水平增加的情況下仍能進(jìn)行廣泛增殖。除了端粒及端粒酶的影響，NSCs 活性還受DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等多種表觀遺傳變異因素的調(diào)控。在衰老過程中，染色質(zhì)組織會(huì)發(fā)生顯著變化，從而改變轉(zhuǎn)錄水平。有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchyma stem cell，MSCs）中甲基化CpG 結(jié)合蛋白2（MECP2）的部分沉默能夠誘導(dǎo)MSCs 的衰老，同時(shí)導(dǎo)致受損DNA 的增加[27]。最近，Melone 等[28]還發(fā)現(xiàn)，MECP2 基因缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)衰老的NSCs 數(shù)量增加、增殖能力降低且未修復(fù)的DNA病灶積累，最終加速神經(jīng)系統(tǒng)的衰老。上述研究表明，NSCs 的衰老受基因、蛋白修飾、端粒長度及活性等諸多因素的影響。因此，解決NSCs 的衰老問題不僅要從蛋白水平進(jìn)行調(diào)控，還需要尋找與衰老相關(guān)的基因靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)蛋白和基因水平的雙項(xiàng)調(diào)控。

與活化的NSCs 一樣，未經(jīng)活化的靜息NSCs也同樣面臨衰老的問題。機(jī)體內(nèi)貯存干細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu)通常稱為干細(xì)胞池（stem cell pool），這些干細(xì)胞池內(nèi)不僅包含活化的干細(xì)胞，還包含靜息干細(xì)胞。它們的種類各異，作用相似。然而到目前為止，維持增殖和衰老的機(jī)制尚不清楚。例如，如何維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和處理蛋白質(zhì)聚集在很大程度上是未知的。Brunet 等[29]的最新研究指出，靜息與活化狀態(tài)的NSCs 在蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡(luò)上存在不同，活化的NSCs 擁有活性蛋白酶體，而靜息的NSCs 含有大的溶酶體，溶酶體內(nèi)儲(chǔ)存著不斷積累的蛋白質(zhì)聚集體，同時(shí)靜息NSCs 中溶酶體活性的波動(dòng)會(huì)影響蛋白質(zhì)聚集體積累和靜息NSCs激活的能力。當(dāng)NSCs 處于衰老狀態(tài)時(shí)，靜息的NSCs 在其溶酶體活性上顯示出缺陷，且蛋白質(zhì)聚集體的積累增加，導(dǎo)致活化能力降低。這也提示可以通過激活衰老NSCs 中的溶酶體或者讓NSCs處于饑餓狀態(tài)來限制其蛋白合成，從而清除干細(xì)胞池內(nèi)的蛋白聚合物，恢復(fù)衰老NSCs 的活化能力，使靜息NSCs 重新呈現(xiàn)年輕態(tài)。

5 結(jié)語

神經(jīng)退行性疾病主要由大腦或脊髓中的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞受損引起。與傳統(tǒng)的康復(fù)治療和長期藥物維持治療相比，近年來，日趨成熟的干細(xì)胞移植治療法為神經(jīng)退行性疾病患者帶來新的希望。由于NSCs 能夠分化為神經(jīng)元及各種膠質(zhì)細(xì)胞，使其成為干細(xì)胞治療的重要細(xì)胞來源之一。一項(xiàng)最新研究指出，星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能障礙是神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的驅(qū)動(dòng)因素，而星形膠質(zhì)細(xì)胞是由NSCs 后期分化產(chǎn)生[30]。因此，NSCs 在治療神經(jīng)退行性疾病方面存在巨大潛力。相信通過對(duì)NSCs 的衰老及自噬的不斷研究，定會(huì)解決體外培養(yǎng)NSCs 的早衰及功能減退等問題，最終實(shí)現(xiàn)從根本上治療神經(jīng)退行性疾病。