高 楓 趙 琳 楊彥玲

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延安 716000)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，迄今為止無有效的臨床治療方法[1]。SCI可引起神經(jīng)元的損傷，并伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞(Asrocyte，AS)的活化和增生，神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷等多種生理病理過程均可見AS的身影，SCI中抗氧化損傷也是一個重要的方法[2，3]。此外，AS對氧化損傷較敏感且是易受損傷的細(xì)胞，是加重SCI的因素[4]。姜黃素是中藥姜黃的一個主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的生物活性[5]。有研究顯示，姜黃素能降低由LPS激活所導(dǎo)致的AS炎癥反應(yīng)；可呈劑量依賴性保護(hù)丙烯腈導(dǎo)致的AS損傷[6，7]。對于過氧化氫(H2O2)導(dǎo)致SCI后AS的影響還未清楚。因此，本研究通過H2O2建立SCI模型，探討姜黃素對SCI后AS凋亡及炎癥因子IL-6、TNF-α的影響，并研究可能的分子機(jī)制，為脊髓損傷的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 姜黃素購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，貨號為C1386，細(xì)胞實(shí)驗的配置方法為：將37.5 mg姜黃素溶解于DMSO 1 ml中，得到1 000 μmol/L的儲存濃度，使用時在1 ml培養(yǎng)基中加入姜黃素1 μl，得到1 μmol/L的姜黃素濃度。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco；過氧化氫(H2O2)為國產(chǎn)分析純；ELISA試劑盒購自美國PeproTech公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒及流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)、Notch1和Hes1抗體均購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞(ASrocyte，AS)的培養(yǎng)與鑒定 新生1～3 d SPF級SD大鼠，共2只，體重為3～5 g，購自延安動物中心；大鼠用乙醇消毒后斷頭，眼科剪從頸部依次剪開背部皮膚及脊柱，使脊髓能夠充分暴露，取出脊髓至已加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)皿中。眼科剪小心剝離血管和脊膜，多次洗滌后剪碎，1 500 r/min離心5 min，加入胰酶，置于37℃水浴箱中消化15 min，完全培養(yǎng)基中止消化，轉(zhuǎn)移至離心管離心，離心后去掉上清，與含血清DMEM培養(yǎng)基充分混勻，重懸后過200目篩，細(xì)胞以107～109個/L濃度加入至含有適量血清DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃和5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中1 h(差速貼壁，以去除掉成纖維細(xì)胞)，將未貼壁的細(xì)胞懸液取出，細(xì)胞密度調(diào)整為1.0×106ml-1，以此密度接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d進(jìn)行一次換液，細(xì)胞達(dá)90%生長融合后，37℃條件下，260 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，以將小膠質(zhì)細(xì)胞除去，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱1 h，200 r/min，37℃條件下振蕩18 h，以將少突膠質(zhì)細(xì)胞除去，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，換液，培養(yǎng)1 d胰酶進(jìn)行消化后傳代，實(shí)驗為第三代細(xì)胞。

免疫熒光檢測細(xì)胞中Vimentin和GFAP表達(dá)變化。取適量星型膠質(zhì)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105接種于含多聚賴氨酸包被玻片的24孔板中，24 h待細(xì)胞貼壁后，4%多聚甲醛固定20 min，用含0.3% Triton-X100的血清封閉1 h，加入兔抗鼠Vimentin或GFAP一抗4℃孵育過夜，加入相應(yīng)FITC標(biāo)記二抗和DAPI于37℃避光孵育1 h，吸取多余抗體晾干后用熒光抗淬滅劑封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2AS損傷模型建立 取長滿皿底80%～90%的第三代AS，將細(xì)胞濃度調(diào)整為105ml-1，每孔100 μl接種于96孔板，觀察到細(xì)胞單層鋪滿孔底部后，用0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L的過氧化氫(H2O2)處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，每細(xì)胞孔中加入CCK8溶液10 μl，酶標(biāo)儀測定570 nm波長吸光度值(OD值)，OD值可反映細(xì)胞的代謝活性，可間接地反映出細(xì)胞活力和存活數(shù)量。抑制率(IR)=(1-實(shí)驗組OD值/對照組OD值)×100%。取對細(xì)胞有50%抑制率的H2O2建立AS損傷模型。

1.2.3分組及各組AS凋亡檢測 AS細(xì)胞分為正常對照組、H2O2組和H2O2+姜黃素組。其中正常對照組細(xì)胞未經(jīng)特殊處理，H2O2組細(xì)胞用0.4 mmol/L的H2O2處理細(xì)胞24 h，H2O2+姜黃素組先用1 μmol/L的姜黃素處理細(xì)胞，2 h后再用0.4 mmol/L 的H2O2處理細(xì)胞24 h。收集按照分組處理至?xí)r間的各組細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，具體操作參照試劑盒。

1.2.4AS上清液中IL-6、TNF-α含量檢測 收集各組AS培養(yǎng)的上清液，參照ELISA試劑盒的操作說明檢測各組細(xì)胞中IL-6、TNF-α的含量。參照IL-6和TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出含量，含量用pg/ml表示。

1.2.5各組細(xì)胞中ROS含量檢測 采用熒光探針2′，7′-二氯二氫熒光素黃二乙酸酯(DCFH-DA)，通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞中ROS含量。磷酸鹽緩沖液洗滌已處理好的各組細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，含血清的培養(yǎng)基終止消化，離心后棄掉上清，加入1 ml的DCFH-DA應(yīng)用液重懸細(xì)胞，置于37℃條件下避光30 min。離心，棄掉上清，加入1 ml的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，重復(fù)2次操作，0.5 ml的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，其中發(fā)射波長為525 nm，激發(fā)波長為488 nm。熒光強(qiáng)度的大小與ROS水平呈現(xiàn)正相關(guān)，因此可以用熒光強(qiáng)度間接反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.6各組細(xì)胞中Cleaved Caspase3、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)檢測 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量總蛋白，每泳道40 μg蛋白行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后依次進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、孵育一抗，Cleaved Caspase3、Bax、Notch1和Hes1抗體均按照1∶500稀釋，GAPDH抗體按照1∶1 000稀釋，洗膜后孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶1 000 稀釋)，洗膜，化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)曝光顯色。

2 結(jié)果

2.1脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞(Asrocyte，AS)的培養(yǎng)與鑒定 將分離得到的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后大部分細(xì)胞已貼壁，經(jīng)16～18 h恒溫?fù)u床振蕩并換液后，倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞伸出細(xì)小突起，胞體較大，細(xì)胞形態(tài)多樣不規(guī)則(圖1A)。傳代培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，胞體體積明顯變大，突起明顯增多增長，部分突起交織互聯(lián)(圖1B)。培養(yǎng)10 d后，細(xì)胞生長迅速，分支突起相互交織連接成網(wǎng)狀(圖1C)。本實(shí)驗分離得到的星型膠質(zhì)細(xì)胞幾乎都表達(dá)Vimentin蛋白， 但在培養(yǎng)初期僅有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)，隨著培養(yǎng)實(shí)驗延長，GFAP陽性細(xì)胞越來越多，培養(yǎng)10 d后，GFAP星型膠質(zhì)細(xì)胞陽性率達(dá)95%以上(圖1D)，絕大部分細(xì)胞為星型膠質(zhì)細(xì)胞。

圖1 脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of spinal astrocytesNote:A.Morphology of spinal cord Astrocytes after 2 days of culture(Vimentin green fluorescence is 100%,DAPI blue is present in the nucleus);B.Morphology of spinal cord Astrocytes after 5 days of culture(100% Vimentin green fluorescence.The nucleus is DAPI blue);C.Morphology of spinal cord astrocytes after 10 days of culture(cells express Vimentin green fluorescence 100%,DAPI blue cells);D.GFAP immunofluorescence staining in Spinal astrocytes(The nucleus is DAPI blue and GFAP is FITC green)

2.2H2O2對AS活力的影響 不同濃度的H2O2處理AS 24 h，通過CCK8檢測H2O2對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如表1所示，不同濃度的H2O2均可抑制AS活力，且隨H2O2濃度升高細(xì)胞抑制率升高，與0.1 mmol/L H2O2比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t1=2.734，P1=0.018；t2=5.851，P2=0.000；t3=8.103，P3=0.000；t4=9.277，P4=0.000；t5=12.332，P5=0.000)，由于0.4 mmol/L的H2O2可抑制一半的AS活力，選擇作為研究對象。

2.3姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS凋亡的影響 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS凋亡的影響，結(jié)果如圖2和表2所示，與正常對照組比較，H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著升高(t=16.668，P=0.000)，與H2O2組比較，H2O2+姜黃素組細(xì)胞凋亡率顯著降低(t=14.067，P=0.000)。

2.4姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS中IL-6、TNF-α含量的影響 IL-6、TNF-α含量檢測結(jié)果如表3所示，

表1 H2O2對AS活力的影響

Note：Compared with the H2O2of 0.1 mmol/L，1)P<0.05.

圖2 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS凋亡的影響Fig.2 Effect of curcumin on AS apoptosis induced by H2O2

表2 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS凋亡的影響

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the H2O2group，2)P<0.05.

表3 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS中IL-6、TNF-α含量的影響

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the H2O2group，2)P<0.05.

表4 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS中ROS含量的影響

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the H2O2group，2)P<0.05.

圖3 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS中ROS含量的影響Fig.3 Effect of curcumin on content of ROS in AS induced by H2O2

表5 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS中Cleaved Caspase3、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的影響

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the H2O2group，2)P<0.05.

H2O2組IL-6和TNF-α含量均顯著高于正常對照組(t1=8.457，P1=0.000；t2=15.578，P2=0.000)，而H2O2+姜黃素組IL-6和TNF-α含量均顯著低于H2O2組(t1=4.878，P1=0.003；t2=7.114，P2=0.000)。

2.5姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS中ROS含量的影響 以流式細(xì)胞儀檢測的熒光強(qiáng)度間接反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果如表4所示，與正常對照組比較，H2O2組細(xì)胞ROS含量顯著升高(t=7.996，P=0.000)，與H2O2組比較，H2O2+姜黃素組細(xì)胞ROS含量顯著降低(t=3.736，P=0.010)。

2.6黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS中Cleaved Caspase3、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的影響 通過Western blot檢測各組細(xì)胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase3、Bax及Notch信號通路Notch1和Hes1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2和表5所示，與正常對照組比較，H2O2組細(xì)胞Cleaved Caspase3、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)均顯著升高(t1=13.334，P1=0.000；t2=11.482，P2=0.000；t3=14.278，P3=0.000；t4=10.879，P4=0.000)，與H2O2組比較，H2O2+姜黃素組細(xì)胞Cleaved Caspase3、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)均顯著降低(t1=6.235，P1=0.001；t2=5.611，P2=0.001；t3=10.303，P3=0.000；t4=4.841，P4=0.003)。

圖4 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的AS中Cleaved Caspase3、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of curcumin on expression of Cleaved Caspase3，Bax，Notch1 and Hes1 in AS induced by H2O2Note:1.Control group;2.H2O2group;3.H2O2+ Cur group.

3 討論

AS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)所占數(shù)量和體積最大的一種膠質(zhì)細(xì)胞，幾乎在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中遍布，在SCI后對脊髓的保護(hù)及炎癥反應(yīng)，很大程度上通過AS起作用[8]。因此，本研究選擇AS作為研究細(xì)胞。H2O2是主要的一種活性氧形式，目前已被證實(shí)能介導(dǎo)細(xì)胞的損傷，也可通過作用于信號分子引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的途徑而使細(xì)胞發(fā)生死亡[9]。H2O2損傷模型是經(jīng)典的損傷模型，已在多種細(xì)胞氧化損傷實(shí)驗中成功應(yīng)用[10，11]。因此本研究使用H2O2制作體外培養(yǎng)的鼠脊髓AS模型，模擬SCI損傷時H2O2引起的AS損傷。姜黃素是姜黃的主要活性成分，可穿過血腦屏障，且能保持高的生物活性[12]。近些年研究顯示，姜黃素可廣泛地應(yīng)用于神經(jīng)保護(hù)，能有效的預(yù)防和治療帕金森病、阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病[13，14]；能抑制由LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎癥因子分泌增多[15]。

本研究通過H2O2處理AS，發(fā)現(xiàn)不同濃度的H2O2均可抑制AS活力，而0.4 mmol/L的H2O2可抑制一半的AS細(xì)胞活力，因此選擇此濃度建立AS損傷模型，流式細(xì)胞儀檢測姜黃素對AS凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)H2O2可誘導(dǎo)AS凋亡，而姜黃素可抑制AS凋亡。ROS可由活化中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生，ROS的過量產(chǎn)生可引起細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂，破壞核酸，最終引起細(xì)胞發(fā)生死亡[16]?？寡趸委熆擅黠@降低SCI損傷[17]。此外，細(xì)胞的凋亡還受到Caspase家族和Bcl-2家族的調(diào)控，Caspase3為Caspase家族的關(guān)鍵酶，Caspase3的活化可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且使凋亡進(jìn)入不可逆[18]。Bax為Bcl-2家族的促凋亡蛋白，其表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓損傷后Caspase3和Bax的表達(dá)升高[20]。本研究檢測AS中ROS含量及Cleaved Caspase3和Bax表達(dá)，發(fā)現(xiàn)H2O2可引起ROS含量及Cleaved Caspase3和Bax表達(dá)升高，而姜黃素可以顯著降低Cleaved Caspase3和Bax的表達(dá)。這提示姜黃素可通過調(diào)節(jié)ROS含量及Cleaved Caspase3和Bax表達(dá)方式降低SCI后AS的凋亡。IL-6為微血管損傷及創(chuàng)傷后炎癥的重要介質(zhì)，可刺激AS的增加，TNF-α為一種多效的細(xì)胞因子，可增加炎癥反應(yīng)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，SCI后IL-6和TNF-α的表達(dá)均明顯升高[22]。本研究的結(jié)果顯示，H2O2可增加AS中IL-6和TNF-α產(chǎn)生，而姜黃素可降低IL-6和TNF-α含量。這提示姜黃素可通過降低炎癥反應(yīng)對SCI起到保護(hù)作用。Notch信號通路是一條在進(jìn)化上保守的信號途徑，影響細(xì)胞的生長、凋亡、發(fā)育等過程，研究發(fā)現(xiàn)，SCI后Notch信號通路被激活，抑制該通路后可減輕SCI[23，24]。本研究檢測Notch信號通路因子Notch1和下游重要靶基因Hes1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)姜黃素可降低由H2O2引起的Notch1和Hes1表達(dá)水平的升高。

綜上所述，姜黃素可通過下調(diào)Notch信號通路降低脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、ROS含量及炎癥因子IL-6和TNF-α含量，從而對脊髓損傷起保護(hù)作用。本研究為姜黃素在SCI研究中奠定了一定的基礎(chǔ)，提示姜黃素可對SCI起到保護(hù)作用，值得進(jìn)一步深入的探討。