畢嘉成 田志剛

(中國科學院深圳先進技術研究院，深圳 518055)

免疫系統(tǒng)分為兩大分支：固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)。由T、B細胞構成的適應性免疫系統(tǒng)，通過體細胞DNA重排，生成數量巨大的抗原識別受體，用以識別多種多樣的環(huán)境抗原；而固有免疫系統(tǒng)則通過種系編碼的識別受體，識別病原體或壓力相關的分子模式。天然殺傷細胞(NK細胞)屬于固有免疫系統(tǒng)。歷史上，NK細胞因其對腫瘤細胞的“天然”殺傷效應而被發(fā)現。其后，大量研究逐漸揭示出NK細胞可借助細胞表面的一系列受體識別腫瘤細胞，通過活化性受體與抑制性受體之間的動態(tài)平衡，觸發(fā)自身活性，從而啟動殺傷靶細胞的過程[1]。同樣重要的是，研究發(fā)現NK細胞除了對腫瘤細胞的直接殺傷，還可通過一系列殺傷以外的機制實現對腫瘤的免疫監(jiān)視效應[2]。然而，早期基于NK細胞的免疫療法療效有限，提示我們早期對NK細胞抗腫瘤免疫應答的認知十分缺乏。近年來對腫瘤相關NK細胞的研究，抗腫瘤效應功能受限的機制有了新的闡釋。在此，我們應用并延伸了T細胞“免疫耗竭”的概念。NK細胞的腫瘤“免疫耗竭”被定義為在腫瘤發(fā)生發(fā)展的情況下NK細胞效應功能低下的狀態(tài)，而該狀態(tài)往往伴隨著NK細胞一系列表型的改變[3]。通過對NK細胞抑制性受體的功能及對NK腫瘤免疫耗竭狀態(tài)的研究，催生了當前NK細胞卡控點免疫治療的研究。一系列處于臨床或臨床前研究階段的“卡控點”，標志著NK細胞已緊隨T細胞的腳步，踏上了“卡控點免疫治療”的舞臺。

1 NK細胞的基本效應功能

NK細胞是宿主免疫的第一道防線，廣泛參與到對病原體及惡性腫瘤的免疫防御等過程中[2]。與T細胞不同，NK細胞不需要經過預先致敏即可被激活并發(fā)揮效應功能。NK細胞通過細胞表面一系列活化性和抑制性受體之間的平衡，對“自我”與“非我”細胞進行識別和區(qū)分，繼而觸發(fā)活性[1]。NK細胞的活化性受體通常識別“壓力”誘導型的配體(如活化性受體NKG2D識別人的ULBP及MIC分子，或識別小鼠的RAE1、H60和MULT1分子)、識別因感染而誘導表達的配體(如小鼠NK細胞活化性受體Ly49H識別小鼠巨細胞病毒所編碼的m157分子)或識別覆蓋在靶細胞上的抗體(通過Fc受體CD16識別抗體Fc段)。而NK細胞的抑制性受體通常識別穩(wěn)態(tài)條件下在自身細胞組成型表達的配體(如通過人的KIR分子或小鼠的Ly49分子識別MHCⅠ類分子)，這些配體的表達在壓力或其他異常情況下可能發(fā)生丟失，從而導致NK細胞接收到的抑制性信號被減弱，觸發(fā)NK細胞的激活。

NK細胞激活后發(fā)生的細胞生物學事件包括與靶細胞形成免疫突觸、重構細胞骨架并釋放胞內儲藏的裂解顆粒，后者所包含的穿孔素與顆粒酶將對靶細胞進行裂解，從而實現殺傷功能[4]；NK細胞也可以通過細胞表面表達的FasL和TRAIL等分子與靶細胞上的配體結合，從而誘導靶細胞凋亡[5,6]；NK細胞還可以通過分泌效應細胞因子(如IFN-γ和TNF-α)，直接抑制靶細胞生長，或通過影響其他免疫效應細胞，來行使效應功能[7-12]。

2 NK細胞在腫瘤免疫應答中發(fā)揮重要作用

殺傷活性是NK細胞的特征性效應功能，NK細胞殺傷活性的低下往往與較高的癌癥發(fā)生率有關[13]。NK細胞通過包括殺傷活性在內的一系列效應功能，在生理環(huán)境下對腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視作用。

首先，NK細胞公認能在控制血液系統(tǒng)的腫瘤和控制腫瘤發(fā)生及轉移方面發(fā)揮顯著作用。比如在發(fā)生腫瘤轉移的淋巴結里，表征NK細胞殺傷潛能的NK細胞表面活化性受體NKp30及NKG2D的表達水平與腫瘤轉移到淋巴結的水平呈現負相關的關系[14]，提示NK細胞的殺傷活性在控制腫瘤轉移方面發(fā)揮重要作用。而來自小鼠模型的證據表明，NK細胞控制腫瘤轉移的機制主要是通過穿孔素和IFN-γ，比如在前列腺癌和乳腺癌的肺轉移小鼠模型中，穿孔素或IFN-γ缺失的小鼠，其腫瘤肺轉移的嚴重程度，與NK細胞缺失小鼠的腫瘤肺轉移水平接近[15,16]。其中，NK細胞所產生的IFN-γ導致腫瘤轉移減少的機制，被報道是通過誘導腫瘤細胞產生細胞外基質蛋白纖連蛋白1，對腫瘤造成結構性改變，從而發(fā)揮作用[17]。此外，NK細胞產生的IFN-γ還能控制化學物誘導腫瘤的發(fā)生[16]。除了IFN-γ和穿孔素，在肝臟中，由于肝臟特有NK細胞高表達TRAIL分子，因而NK細胞也通過TRAIL依賴的方式控制腫瘤對肝臟的轉移[18]。NK細胞控制腫瘤轉移的機制可能還體現在，由于發(fā)生上皮-間質轉化的細胞通過誘導表達E-cadherin和CADM1分子，使自身更容易被NK細胞識別殺傷，從而使這些細胞不容易發(fā)生轉移[19]。

NK細胞不僅能對血液腫瘤和腫瘤發(fā)生及轉移發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，其對實體腫瘤的浸潤也影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。比如，頭頸癌患者腫瘤局部表征NK細胞標志NKp46分子Ncr1水平較高的患者表現出較好的預后[20]；在結腸癌、胃癌、肺癌等實體腫瘤局部，NK細胞的浸潤水平也與患者較好的預后相關[21-23]。

近年來，T細胞卡控點免疫治療的臨床應用對NK細胞在腫瘤免疫應答中的重要性有了新的詮釋，研究表明NK細胞的抗腫瘤功能還體現在對T細胞抗腫瘤免疫應答及基于T細胞的卡控點免疫治療的輔助效應上。首先，NK細胞的清除在黑素瘤小鼠模型中會導致荷瘤小鼠外周及腫瘤局部T-bet+CD4+T細胞的減少，腫瘤浸潤CD8+T細胞產生效應分子的能力下降，而且表達更高水平的免疫耗竭分子PD-1，而純化的NK細胞能通過IFN-γ及NKG2D依賴的方式促進Th1細胞的分化，這些證據顯示出在腫瘤模型中NK細胞對抗腫瘤T細胞具有重要的輔助效應[24-25]。

這種輔助效應對于T細胞的卡控點免疫治療具有重要意義。有研究組通過比較應答或不應答PD-1卡控點免疫治療的腫瘤患者的腫瘤浸潤免疫細胞，分析各免疫細胞群體的多少與應答卡控點免疫治療之間的關系。他們發(fā)現應答卡控點免疫治療的患者腫瘤局部浸潤了更多的NK細胞[26]。這個現象不僅表明腫瘤局部NK細胞浸潤的多少也許可以作為預測基于T細胞的卡控點治療療效的標志物，而且表明NK細胞的存在可以間接影響T細胞的抗腫瘤免疫應答強度。類似證據在小鼠模型中同樣被觀察到：研究者發(fā)現如果用抗NK-1.1單克隆抗體PK136預先注射小鼠以清除NK細胞，則當用抗PD-L1單克隆抗體治療該荷瘤小鼠時，抗腫瘤的療效會大打折扣，小鼠生存期顯著縮短[25]。因而，NK細胞的存在及其活性，在基于T細胞的卡控點免疫治療中具有重要的作用。

3 NK細胞免疫耗竭及其機制

盡管NK細胞對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要的監(jiān)控作用，但在腫瘤局部，NK細胞往往處于功能低下的免疫耗竭狀態(tài)，限制著NK細胞抗腫瘤潛能的發(fā)揮。這種功能低下首先表現在NK細胞“數量”的低下。比如，在自發(fā)多發(fā)性骨髓瘤的小鼠模型中，隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，NK細胞的比例逐漸下降[27]。其次，NK細胞的“質量”發(fā)生下降，體現在殺傷能力與產生效應細胞因子能力的下降。在小鼠黑素瘤模型中，腫瘤局部的NK細胞，和外周NK細胞相比，產生IFN-γ和GM-CSF的水平顯著降低[24]。在肝癌及肺癌等腫瘤患者的腫瘤局部也能觀察到NK細胞IFN-γ產生水平降低的現象[28,29]。而在乳腺癌、胰腺癌、胃癌及結腸癌等腫瘤患者的腫瘤局部，NK細胞殺傷能力下降[30]，伴隨著NK細胞表達殺傷相關分子顆粒酶、穿孔素、FasL和TRAIL分子的水平發(fā)生下降[31]。在帶有腫瘤的宿主體內，NK細胞效應功能的下降會伴隨著NK細胞的穩(wěn)態(tài)增殖而快速發(fā)生[32]。

NK細胞的腫瘤免疫耗竭還往往與腫瘤局部NK細胞異常表達的受體及其在腫瘤或腫瘤相關的其他細胞上異常表達的配體群譜有關。腫瘤浸潤NK細胞會在一些免疫抑制性細胞因子等因素的誘導下，高水平地表達一系列抑制性細胞表面受體，這些受體通過與腫瘤微環(huán)境中的配體相互作用，逐漸誘導NK細胞進入效應功能低下的免疫耗竭狀態(tài)。T細胞的卡控點分子PD-1和CTLA-4誘導T細胞免疫耗竭的機制已得到深入研究。但相比腫瘤浸潤的T細胞，腫瘤浸潤NK細胞上所表達的T細胞卡控點分子PD-1或CTLA-4的水平很低[25]。相對的腫瘤相關NK細胞特有的“NK細胞卡控點分子”研究，近年來逐漸受到關注。

TIGIT是表達在T細胞和NK細胞表面的抑制性受體，TIGIT可能通過細胞內的ITIM結構域及ITT樣結構域轉導抑制性信號，或與配體PVR相互作用觸發(fā)其下游的信號[33]，或與活化性受體CD226競爭配體削弱活化性信號，來發(fā)揮抑制性效應[33-37]。TIGIT在體外能通過與配體相互作用，抑制NK細胞的殺傷功能和分泌IFN-γ的功能[34,38,39]；而在體內，通過調控NK細胞與巨噬細胞、組織細胞、腫瘤細胞等之間的相互作用，負調節(jié)NK細胞的效應功能，從而一方面在急性炎癥過程中避免過度組織損傷、在損傷后修復再生的過程中使組織修復能正常進行[25,40，41]，但另一方面，在抗腫瘤免疫應答過程中，TIGIT卻能誘導NK細胞進入免疫耗竭狀態(tài)[25]。

通過分析結腸癌患者的腫瘤局部NK細胞，研究者發(fā)現腫瘤浸潤NK細胞和腫瘤旁正常組織NK細胞相比，表達更高水平的TIGIT分子；而在小鼠模型中，TIGIT分子在小鼠腫瘤浸潤NK細胞上高水平表達，其表達水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及荷瘤小鼠NK細胞低下的功能呈現相關性[25]。TIGIT陽性與TIGIT陰性的腫瘤浸潤NK細胞群體相比，TIGIT陽性NK細胞往往伴隨著NK細胞效應分子表達水平的下降、細胞表面活化性受體的降低及細胞表面抑制性受體的升高，表明與TIGIT陰性NK細胞相比，TIGIT陽性NK細胞處于功能更加低下的免疫耗竭狀態(tài)[25]。因而，種種證據顯示，TIGIT分子是NK細胞腫瘤免疫應答的“卡控點分子”。

CD96早期被發(fā)現介導NK細胞與腫瘤細胞之間的黏附，從而促進NK細胞對腫瘤細胞的殺傷功能[42]；但后期CD96-/-小鼠模型的數據顯示，CD96的缺失會導致NK細胞被激活時展現出更強的效應功能，而且CD96的缺失使小鼠以NK細胞及IFN-γ依賴的方式，對化學物誘導的癌癥表現出更強的抵抗力，從而揭示出CD96是NK細胞表面一個重要的抑制性受體[43]。

肝癌患者腫瘤局部浸潤的NK細胞和腫瘤外周組織NK細胞或正常人肝組織NK細胞相比，表達CD96的陽性比例、表達強度及CD96+細胞的數量均顯著增加[44]?；颊哐逯械腡GF-α可能介導了CD96表達水平的升高[44]。CD96+NK細胞呈現出功能耗竭的狀態(tài)，表現為效應分子IFN-γ和TNF-α產生水平的降低，與效應功能相關的基因Tbx21、IL-15、Prf1和Gzmb表達水平下降，而免疫抑制性細胞因子IL-10和TGF-β的基因表達水平升高[44]。重要的是，肝癌患者腫瘤局部高水平的CD96或其配體CD155的表達與較差的疾病預后相關[44]。因而，CD96與NK細胞在腫瘤局部的免疫耗竭狀態(tài)相關，是腫瘤相關NK細胞另一個備受關注的“卡控點分子”。

在肝癌患者的腫瘤局部，腫瘤浸潤NK細胞高表達NKG2A分子，而肝癌組織同時高表達其配體HLA-E分子；腫瘤浸潤NKG2A+NK細胞的功能效應分子表達呈現下降的現象，而腫瘤局部NKG2A、HLA-E分子的表達水平與腫瘤患者較差的預后呈現負相關性[29]。這顯示NKG2A-HLA-E受配體之間的相互作用與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，而且介導了腫瘤浸潤NK細胞的功能耗竭。腫瘤浸潤NK細胞上調表達的NKG2A可能是由腫瘤患者血清中較高水平的IL-10所誘導的，因為腫瘤組織IL-10的mRNA水平和NKG2A+腫瘤浸潤NK細胞的比例呈正相關，而且如果在體外用單克隆抗體阻斷IL-10，則腫瘤患者血清處理下的NK細胞所誘導的NKG2A水平會有所下降[29]?？梢?，NKG2A也是表征腫瘤相關NK細胞免疫耗竭狀態(tài)的一個重要標志。

盡管和以上的抑制性受體相比，PD-1在NK細胞上的表達水平相對較低，僅在病毒感染的過程中在特定組織有較明顯的表達[45]。但有研究表明人和小鼠的NK細胞在一些腫瘤微環(huán)境或荷瘤宿主的外周血中會上調表達PD-1分子[20]。然而和NK細胞所表達的TIGIT、CD96等抑制性受體不同，腫瘤患者外周血NK細胞PD-1的表達表征著一群效應潛能更強的NK細胞，這些細胞在體外用IL-2刺激，能產生更高水平的IFN-γ和顆粒酶B[20]；但是在NK細胞與PD-L1+靶細胞接觸的情況下，PD-1分子的下游信號被觸發(fā)，將使這群NK細胞的功能受到抑制[20]。因而，腫瘤浸潤NK細胞上調表達的PD-1分子，在PD-L1表達較高的腫瘤局部，可能呈現出功能低下的免疫耗竭狀態(tài)。

除了細胞表面受體表達譜的改變，NK細胞的腫瘤免疫耗竭還與NK細胞關鍵信號通路的改變有關。IL-15的信號對NK細胞的發(fā)育、存活及功能具有重要的作用[46,47]，而荷瘤小鼠NK細胞的IL-15受體信號通路存在受損的情況，導致NK細胞成熟水平的降低及IFN-γ產生能力的削弱；而IL-15的過表達能逆轉這些缺陷[48]。這些證據顯示IL-15信號通路的受損是腫瘤相關NK細胞的重要特征，并與NK細胞的免疫耗竭狀態(tài)關系密切。

4 NK細胞的卡控點免疫治療

T細胞的卡控點免疫治療為腫瘤治療開辟了全新的領域，然而越來越多研究表明腫瘤局部可能存在多種因素限制著T細胞腫瘤免疫療法的效果，從而使療效僅能惠及小部分患者[49]。因而，除了T細胞免疫療法外，有必要研究并開發(fā)出替代的免疫治療策略?；谶@樣的考慮，再加上NK細胞本身存在強大的抗腫瘤效應潛能，其識別腫瘤的機制與T細胞相比存在差異優(yōu)勢，而且能對T細胞的抗腫瘤應答提供輔助，因而基于NK細胞的免疫治療在腫瘤免疫治療研究中逐漸受到關注。其中，通過單克隆抗體靶向NK細胞表面抑制性受體的NK細胞卡控點免疫治療，得益于相關靶點良好的成藥性、單克隆抗體技術的發(fā)展及T細胞卡控點免疫治療的成功，近年來相關研究進展迅速，并逐漸顯示出治療潛力(圖1)。

對NK細胞卡控點免疫治療的探索始于KIR分子。早期對急性髓系白血病患者進行的骨髓移植研究顯示，若供體NK細胞的KIR分子與受體MHCⅠ分子匹配時，患者的五年復發(fā)率為75%，但KIR與MHCⅠ分子不匹配時患者的五年復發(fā)率卻降到0[50]，該證據表明NK細胞抑制性受體KIR與組成型表達的配體MHCⅠ之間識別的缺失會觸發(fā)NK細胞的活性，并對該細胞進行排斥，因而有可能通過單克隆抗體阻斷KIR分子與MHCⅠ分子之間的識別來調動NK細胞對抗腫瘤效應。在臨床試驗中，KIR的單獨阻斷對急性髓系白血病未能顯示療效(NCT01687387)，與CTLA-4的聯合阻斷也未顯示比CTLA-4單獨阻斷更好的療效(NCT01750580)，但當KIR與PD-1聯合阻斷時，在經化療無效的晚期頭頸癌患者中初步展現出客觀緩解率上升的趨勢(NCT01714739)?；贙IR的阻斷，目前仍有更多的單獨或聯合治療研究正在進行中。對新適應證的探索及對已有臨床試驗數據的進一步挖掘，有望進一步展現阻斷KIR這一策略在腫瘤治療中的潛力。

圖1 NK細胞的“卡控點”免疫治療Fig.1 NK-cell checkpoint blockade immunotherapyNote: A.In tumor microenvironment,NK cells highly express inhibitory "checkpoint" receptors. Dominating inhibitory signaling leads to the hypofunctional "exhaustion" status of NK cells,compromising the tumor immunosurveillance by NK cells;B.NK-cell checkpoint immunotherapy employs monoclonal antibodies blocking the interations between "checkpoint" receptors and their ligands,reversing the exhaustion of NK cells,and unleashing the anti-tumor effector functions of NK cells.

與KIR相比，NK細胞卡控點分子TIGIT的表達模式由于呈現出腫瘤相關性，因而阻斷TIGIT分子與配體之間識別的治療策略，有可能在腫瘤治療中具有獨特的表現。在小鼠腫瘤模型中，抗TIGIT的單克隆抗體注射能恢復腫瘤浸潤NK細胞的功能指標CD107a、TNF-α和IFN-γ的產生水平，并使結腸癌在小鼠體內生長受到顯著抑制，并能在化學物誘癌模型中使誘導成瘤的時間顯著延緩，而且能顯著抑制乳腺癌細胞的轉移[25]；重要的是，在缺失T細胞的SCID小鼠中，靶向TIGIT的單克隆抗體也能顯著抑制腫瘤生長[25]，并伴隨著NK細胞產生更高水平的CD107a、TNF-α等效應分子/標志，這說明靶向TIGIT能在不依賴T細胞的情況下，單獨依靠逆轉NK細胞的耗竭狀態(tài)激發(fā)抗腫瘤效應。

用單克隆抗體中和CD96的功能，在小鼠模型中顯著地降低腫瘤的轉移，其發(fā)揮效應的機制是通過NK細胞、CD226及IFN-γ[51]，而不依賴于對CD96-CD155相互作用的阻斷效應[52]。當與CTLA-4或PD-1的阻斷、Tigit基因的缺失或化療藥物聯用時，靶向CD96的治療效應更加顯著[51]。

靶向NKG2A的單克隆抗體，能同時阻斷腫瘤浸潤NK細胞及T細胞的NKG2A對腫瘤細胞表達的配體HLA-E分子的識別，從而同時調動NK細胞及T細胞的抗腫瘤潛能，并能與PD-L1抗體起協(xié)同作用，在小鼠模型中誘導腫瘤的消退、荷瘤小鼠生存率的顯著延長[53,54]。目前靶向NKG2A的IgG4單克隆抗體與PD-L1(NCT02671435)或EGFR(NCT02643550)的單克隆抗體聯用，分別用于治療結腸癌或頭頸癌的Ⅱ期臨床試驗正在進行中，最新的臨床數據已初步展現出聯合用藥的協(xié)同效應[53]。

因而，通過單克隆抗體阻斷NK細胞“卡控點分子”抑制性受體與其配體之間的相互作用，能逆轉NK細胞的腫瘤免疫耗竭，解除腫瘤微環(huán)境中抑制性信號對NK細胞功能的限制作用，并往往能與現存的T細胞卡控點免疫療法聯合，起協(xié)同效應，同時調動NK細胞和T細胞的抗腫瘤效應，從而實現增強的療效。

5 展望

T細胞卡控點免疫療法在臨床的應用逐步展示了免疫療法的潛力，但在種種因素的限制下，當前T細胞卡控點免疫療法只能使小部分患者獲益。為了充分調動免疫系統(tǒng)的抗腫瘤潛力，有必要對同樣具有強大抗腫瘤潛能的NK細胞進行深入研究。當前NK細胞卡控點免疫療法在動物模型及臨床試驗中的證據已經初步揭示出該策略在解除腫瘤微環(huán)境中的抑制性信號、逆轉NK細胞腫瘤免疫耗竭方面具有顯著作用，但我們仍需要更多更深入的研究，才能充分揭示特定卡控點分子的作用機理、適應證及生物標志物，以指導臨床用藥。隨著研究的深入，期待NK細胞的卡控點免疫治療能充分展示其在腫瘤治療中的潛力。