李慧潔，蔣會敏，賈小同，李小艷，王利娜，尹皓月，李 鈾

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的消費(fèi)水平也逐步提高，消費(fèi)者對食品的安全性有了更高的要求，在國內(nèi)及國際貿(mào)易中，牛、羊肉中摻雜價格便宜的鼠、貓、兔、豬等肉類，以次充好的欺騙行為屢見不鮮，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。在穆斯林國家和地區(qū)，肉類食品的摻假不僅僅是經(jīng)濟(jì)問題，更是宗教問題。在市場中，牛、羊肉中摻雜價格便宜的鼠、貓、兔、豬等肉類，以次充好獲取高額利益，加之近年來瘋牛病、羊瘙癢癥等疾病的出現(xiàn)，肉源性成分的鑒定刻不容緩。隨著PCR技術(shù)在摻假肉檢測中的引入，PCR法、多重PCR法和實(shí)時熒光PCR以其高靈敏度和強(qiáng)特異性逐漸成為肉類鑒別的主要分析方法[1-2]。其中，多重PCR法具有反應(yīng)體系中可擴(kuò)增出多段目的DNA片段[3]的優(yōu)勢，Tettelin H等人[4]已成功進(jìn)行了15多對引物的多重PCR。PCR技術(shù)是一種用于體外擴(kuò)增DNA片段的方法，其反應(yīng)原理類似于 DNA的半保留復(fù)制過程，它的特異性表現(xiàn)在與靶序列兩端互補(bǔ)的核苷酸引物上。人為地給試管中的待擴(kuò)增目標(biāo)DNA樣品提供合適的環(huán)境條件，如模板 DNA、核苷酸引物、DNA聚合酶和合適的緩沖液體系等反應(yīng)所需物質(zhì)，通過控制反應(yīng)液溫度和反應(yīng)時間實(shí)現(xiàn)DNA變性、退火及延伸3個基本過程，然后重復(fù)3個反應(yīng)過程，在若干循環(huán)后實(shí)現(xiàn)DNA片段呈指數(shù)倍擴(kuò)增。多重PCR技術(shù)[5]就是指在單一PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的一種技術(shù)，是將多條引物和多條模板混合在一個反應(yīng)體系中分別特異擴(kuò)增不同的目的條帶，或者多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增同一模板的不同片斷，常用于對超長片斷的擴(kuò)增。和傳統(tǒng)單一的PCR技術(shù)相比，多重PCR技術(shù)具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡便的特點(diǎn)。

PCR技術(shù)具有上述突出優(yōu)點(diǎn)，人們將這一技術(shù)應(yīng)用到不同的領(lǐng)域，使之迅速發(fā)展，取得了巨大的成果，如從事食品病原菌檢測的研究人員將這種技術(shù)引入到食品檢測領(lǐng)域。近年來，基于反應(yīng)的基本原理，許多學(xué)者對PCR技術(shù)進(jìn)行研究和改進(jìn)，使之得到進(jìn)一步完善，并在此基礎(chǔ)上派生出了許多新的用途[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

在市場上購買生鮮的牛肉、豬肉、雞肉和羊肉，保存于-4℃冰箱中。

1.2 試劑與器材

細(xì)胞裂解液、7.8 mol/L醋酸銨，異丙醇，1X TEL，Buffer TE，70%乙醇，dNTPS（2.5 mmol/L），瓊脂糖，蛋白酶K（100μg/mL），細(xì)胞裂解緩沖液，SDS 10%，胰RNA酶 20μg/mL，TE緩沖液（pH值8.0），酚，氯仿，異戊醇（25∶24∶1），冷無水乙醇，高壓滅菌鍋，以及PCR相關(guān)試劑（Premix Taq Version2.0，Takara，500μL）、PCR 儀 （MyGeneTML Series Peltire Thermal Cycler） 和電泳儀（瓊脂糖水平電泳）。

1.3 試驗(yàn)步驟[7-21]

1.3.1 二重PCR反應(yīng)體系建立

（1） DNA提取。運(yùn)用Gentra Puregene Extraction Kit（Gentra Systems Inc.）提供的方法提取肉制品混合物DNA，提取的DNA保存在TE溶液里，作為PCR反應(yīng)的模板。用紫外分分光度計(jì)測試DNA濃度。

（2） 引物設(shè)計(jì)。從文獻(xiàn)里分別查到豬（Cytb）、牛 （Cytb）、雞 （12S rRNA）、羊 （Cytb） 的引物序列，由Takara公司合成（Takara，中國），保存于-20℃冰箱中。

（3） 單重 PCR擴(kuò)增。

單重PCR中不同動物擴(kuò)增的目的基因名稱與大小、擴(kuò)增的引物序列、長度和退火遞度詳見表1，單重PCR反應(yīng)體系詳見表2，單重PCR反應(yīng)程序詳見表3。

1.3.2 二重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

表1 引物的DNA序列、預(yù)擴(kuò)增片段長度、引物名稱、退火梯度

表2 單重PCR反應(yīng)體系

表3 單重PCR反應(yīng)程序

按照擴(kuò)增的目標(biāo)基因大小，將4種動物兩兩組合，即豬牛、牛雞、牛羊、豬雞，豬羊。由于雞和羊大小近似，不容易區(qū)別，因此二重PCR不考慮雞羊組合。

為獲得最佳的二重PCR反應(yīng)體系，首先嘗試了不同的引物濃度、DNA濃度和Premix Taq的濃度，具體PCR反應(yīng)體系如下：

（1） 2種動物的上、下游引物各為1μL，Premix Taq 12.0μL，2種模板DNA各加3.5μL，ddH2O 2μL，體系總體積為25.0μL。

（2） 2種動物的上、下游引物各為1μL，Premix Taq 12.0μL，2種模板DNA各加6.0μL，ddH2O 2μL，體系總體積為30.0μL。

（3） 2種動物的上、下游引物各為1μL，Premix Taq 12.0μL，2種模板DNA各加3.0μL，ddH2O 3μL，體系總體積為25.0μL。

（4） 2種動物的上、下游引物各為0.5μL，Premix Taq12.5μL，2種模板DNA各加3.0μL，ddH2O4.5μL，體系總體積為25.0μL。

（5） 2種動物的上、下游引物各為0.5μL，Premix Taq 12.0μL，2種模板DNA各加3.0μL，ddH2O 5μL，體系總體積為25.0μL。

同時為獲得二重PCR中不同引物組合的最佳退火溫度，試驗(yàn)中為每組引物設(shè)置55～64℃的溫度梯度，因此每組動物需要10個重復(fù)，為避免加樣時試劑的損失，配置Mastermix時按照12個樣本量的試劑量加樣。

最佳退火溫度的確立——二重PCR反應(yīng)體系見表2。

表2 最佳退火溫度的確立——二重PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 二重PCR反應(yīng)體系建立結(jié)果

經(jīng)電泳結(jié)果檢測得出，豬、牛、雞和羊的PCR擴(kuò)增片段大小分別為204，472，131，119 bp。由于雞和羊的擴(kuò)增片段大小過于接近（131和119bp），電泳圖上不易區(qū)分，因此試驗(yàn)中的二重PCR體系使用了5種動物組合，分別為牛和豬、牛和雞、牛和羊、豬和雞、豬和羊。最終確立的二重PCR為25μL體系，包含12.5μL的Premix Taq，每條引物0.4μmol/L，以及每種動物DNA 3～4μL。二重PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 3 min，35個循環(huán)：94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s；延伸72℃ 5 min。

2.2 二重PCR體系優(yōu)化結(jié)果

豬羊、豬雞二重PCR結(jié)果見圖1。

圖1 豬羊、豬雞二重PCR結(jié)果

圖1 左側(cè)中從上到下，分別是500 bp Marker、豬羊模板DNA 1～8、1 000 bp Marker。從圖中清楚可見豬羊模板DNA 1～3均出現(xiàn)了2條不同的明亮條帶，說明這3個豬羊DNA擴(kuò)增較為成功。豬羊模板DNA 4～8均沒有出現(xiàn)條帶。圖中擴(kuò)增的8個豬羊DNA模板，有3個擴(kuò)增成功，說明在上述反應(yīng)體系下擴(kuò)增，豬羊的二重PCR擴(kuò)增成功的概率較高，該反應(yīng)體系可以用于擴(kuò)增豬羊DNA。

圖1右下側(cè)中從上到下，分別是1 000 bp Marker、豬雞模板DNA 1～6。其中，豬雞模板DNA1～2出現(xiàn)2條明顯不同的條帶，圖中6個豬雞模板，有2個擴(kuò)增成功，說明該反應(yīng)體系可以用于研究擴(kuò)增豬雞DNA。

雞羊DNA二重PCR結(jié)果見圖2。

圖2 雞羊DNA二重PCR結(jié)果

圖2 中所有的1 000 bp Marker與500 bp Marker跑的效果均較好，說明膠片制作效果較好。圖2左側(cè)為雞DNA的擴(kuò)增結(jié)果，DNA條帶明亮位于1 000 bp Marker的 100～200 bp，位于 500 bp Marker的 100～150 bp，可以判斷出雞擴(kuò)增長度為120 bp左右。圖2右側(cè)為羊DNA的擴(kuò)增結(jié)果，DNA條帶明亮位于1 000 bp Marker的 100～200 bp，位于 500 bp Marker的 100～150 bp，可以判斷出雞擴(kuò)增長度為130 bp左右。

豬牛DNA，雞牛DNA，牛羊DNA二重?cái)U(kuò)增結(jié)果見圖3。

圖3 豬牛DNA，雞牛DNA，牛羊DNA二重?cái)U(kuò)增結(jié)果

圖3 中所有的1 000 bp Marker與500 bp Marker跑得效果均較好，說明膠片制作效果較好。圖3左側(cè)為豬牛DNA擴(kuò)增的DNA條帶，從上到下分別為豬牛DNA 1～9，其中豬牛DNA 1～5均只有1條DNA條帶，說明這5個的豬牛DNA擴(kuò)增失?。回i牛DNA 6～9均有2條明亮的DNA條帶，說明這4個DNA在該反應(yīng)體系下擴(kuò)增較為成功。圖3右上為牛羊DNA擴(kuò)增的條帶，從上到下分別為牛羊DNA 1～4，這4個DNA均擴(kuò)增出了2條明亮的DNA條帶，說明在上述反應(yīng)體系下擴(kuò)增較為成功。圖3右下為雞牛DNA擴(kuò)增條帶，從上到下分別為雞牛DNA 1～5，這5個DNA均擴(kuò)增出了2條明亮的DNA條帶，說明在此反應(yīng)體系下擴(kuò)增較為成功。

5種動物的二重PCR結(jié)果見圖4。

圖4 5種動物的二重PCR結(jié)果

3 結(jié)論

運(yùn)用單重PCR技術(shù)擴(kuò)增牛、豬、雞、羊的DNA，并對每個樣品做梯度PCR，以尋找各對引物最接近的適宜的退火溫度，為后期二重PCR試驗(yàn)做準(zhǔn)備。豬、牛、雞、羊的退火溫度范圍接近，由于雞羊目的條帶大小十分相同，在電泳圖上不易于區(qū)分，因此在二重PCR時不考慮作為模板DNA。

在二重PCR中通過對PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，尤其是針對6種不同的動物模版組合（牛豬、牛雞、牛羊、豬雞、豬羊、雞羊），設(shè)置退火溫度梯度55～64℃范圍后，對6種二重PCR的電泳圖進(jìn)行了比較，最終確立了55℃為最佳退火溫度。并且6種動物模版組合中，由于雞羊組合的目標(biāo)條帶大小近似（119 bp和131 bp），電泳圖上不宜區(qū)分，因此最終選擇了5種二重PCR：牛豬、牛雞、牛羊、豬雞、豬羊，其反應(yīng)體系均為25μL總體積，上下引物各1μL，模版DNA 3～4 μL，Premix Taq 12.5 μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃3 min，35個循環(huán)：94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；延伸72℃ 5 min。

引物特異性和融合溫度在多重PCR試驗(yàn)中是非常關(guān)鍵的，因其成功取決于在單重PCR條件下引物與其各自靶標(biāo)選擇性退火的能力，包括反應(yīng)體系、循環(huán)次數(shù)和退火溫度。故引物設(shè)計(jì)是PCR發(fā)展中十分重要的一步，需包含足夠的種內(nèi)保守序列和密切相關(guān)的Tm的種間多態(tài)性。

快速檢測出更多肉品的種類和摻假，仍然是我國學(xué)者研究的重點(diǎn)對象，運(yùn)用多重PCR方法似乎是最為快速的一種方式，它具有極高的準(zhǔn)確性，為此希望通過該方法建立一種快速、高效和同時檢測肉制品中多種肉源性成分的方法，為肉類摻假提供更為有利的證據(jù)。