蔡程晨，朱式業(yè)，熊武國，李加興，，易 倩，張廣艷

（1.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南吉首 416000；2.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界 427000；3.湖南省澧縣中醫(yī)醫(yī)院，湖南澧縣 415500）

獼猴桃又叫藤梨、陽桃、獼猴梨[1]，其主要營養(yǎng)成分含量位居其他水果前列，因而有“水果之王”的美譽(yù)[2]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，獼猴桃果實(shí)中含種籽0.8%～1.6%，千粒質(zhì)量1.2～1.6 g，含油量高達(dá)35.6%。獼猴桃籽油中亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸占75%以上，特別是亞麻酸含量達(dá)64.1%，這是目前發(fā)現(xiàn)的除蘇子油外亞麻酸含量最高的天然植物油[3]。有研究表明，獼猴桃籽油具有調(diào)節(jié)血脂、延緩衰老等保健功能和護(hù)膚功效[4]。由此可見，把獼猴桃籽油用于護(hù)膚品領(lǐng)域具有十分廣闊的前景。

存在過多對機(jī)體有破壞作用的自由基，如超氧陰離子、羥基自由基等活性氧自由基會(huì)在生物機(jī)體正常代謝過程中會(huì)產(chǎn)生。在正常情況下，機(jī)體產(chǎn)生的過多自由基會(huì)循序被體內(nèi)的清除劑所清除，因而機(jī)體自由基處于一種動(dòng)態(tài)平衡之中。如果失衡或者清除過慢，過多的自由基會(huì)使生物大分子受到攻擊，加速機(jī)體的衰老進(jìn)程，并誘發(fā)炎癥、惡性腫瘤、免疫失調(diào)等多種疾病[5]。一方面可通過運(yùn)動(dòng)來保證身體內(nèi)的自由基正常，另一方面人們將研究重點(diǎn)放在了抗氧化劑的應(yīng)用上。目前，大部分的抗氧化劑都是通過化學(xué)合成的，會(huì)影響到人體健康，因而天然抗氧化劑引起了人們的廣泛關(guān)注。

獼猴桃籽油作為一種天然抗氧化劑因富含多烯酸、易于氧化而制約了其應(yīng)用，成為在食品與日化品應(yīng)用領(lǐng)域中的技術(shù)瓶頸，因而將其制備成微乳液以提高其氧化穩(wěn)定性，可進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。因此，試驗(yàn)以W/O型獼猴桃籽油微乳液為研究對象，采用加速氧化試驗(yàn)與體外抗氧化模型探討獼猴桃籽油微乳液的氧化穩(wěn)定性和體外抗氧化活性，可為獼猴桃籽油微乳液在食品與日化品領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

獼猴桃籽油，湖南優(yōu)鎰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，采用超臨界萃取工藝提?。涣姿釟涠c、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、濃鹽酸、氫氧化鈉、焦性沒食子酸、過氧化氫、七水合硫酸亞鐵、水楊酸等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2014型電子天平、7230G型可見光分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電子萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S型水浴鍋、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；800型電動(dòng)離心機(jī)，常州市金環(huán)區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；UV-2450型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；BCD-215TS型冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；GZX-9146·MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 獼猴桃籽油微乳液的制備方法

首先，將復(fù)合表面活性劑（吐溫和司盤） 和助表面活性劑按2∶1混合，再按1∶1比例加入IPM與獼猴桃籽油混合油相，然后用微量滴定管逐滴加入去離子水，同時(shí)在一定溫度下攪拌，直至溶液由渾濁變?yōu)槌吻澹ㄐ纬晌⑷橐海?，即可得到獼猴桃籽油微乳液。

1.3.2 獼猴桃籽油微乳液氧化穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用加速氧化試驗(yàn)探討獼猴桃籽油微乳液和普通獼猴桃籽油的氧化穩(wěn)定性。將獼猴桃籽油微乳液和普通獼猴桃籽油放置在65℃干燥箱中，每隔24 h測定其過氧化值，探討不同貯藏時(shí)間對獼猴桃籽油微乳液氧化穩(wěn)定性的影響。

1.3.3 還原能力測定試驗(yàn)

將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質(zhì)量濃度為2，4，6，8，10 mg/mL的獼猴桃籽油微乳液，分別取1 mL上述獼猴桃籽油微乳液于試管中，依次加入0.2 mol/mL pH值6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀2.5 mL，混勻，于50℃水浴中保溫20 min，再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL于試管中，加去離子水2.5 mL和0.1%三氯化鐵0.5 mL，常溫反應(yīng)5 min后于波長700 nm處測定吸光度[6]，以吸光度大小評價(jià)還原能力的高低。以相同濃度VE為陽性對照，臨用前以無水乙醇配制成與試驗(yàn)獼猴桃籽油微乳液同等濃度的對照液。做3次平行。

1.3.4 體外抗氧化活性試驗(yàn)

（1） O2-·清除試驗(yàn)。將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質(zhì)量濃度為3，6，9，12，15 mg/mL，各加入0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，置于25℃水浴鍋預(yù)熱20 min后，分別取1 mL上述獼猴桃籽油微乳液和3 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.1 mL，混勻，于25℃下反應(yīng)5 min后加入濃度8 mmol/L的HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，于波長299 nm處測定樣品溶液的吸光度A1[7]。以相同濃度VE為陽性對照，蒸餾水做空白對照，做3次平行。按下式計(jì)算對·的清除率：

式中：A1——1 mL樣品液+4.5 mL Tris-HCl緩沖液+0.1 mL鄰苯三酚溶液+1 mL HCl溶液；

A2——1 mL樣品液+4.5 mL Tris-HCl緩沖液+0.1 mL鄰苯三酚溶液+1 mL無水乙醇溶液；

A3——1 mL蒸餾水+4.5 mL Tris-HCl緩沖液+0.1 mL鄰苯三酚溶液+1 mL HCl溶液。

（2） DPPH·清除試驗(yàn)。將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質(zhì)量濃度為40，80，120，160，200 mg/mL，分別取3 mL上述超微細(xì)獼猴桃籽油溶液于試管中，加入濃度0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，混勻后避光靜置30 min，于波長517 nm處測定吸光度[8]。以相同濃度VE為陽性對照，臨用前以無水乙醇配制成與試驗(yàn)獼猴桃籽油微乳液同等濃度的對照液。蒸餾水做空白對照，做3次平行。按下式計(jì)算對DPPH·的清除率：

式中：A1——3 mL樣品溶液+2 mL DPPH·溶液；

A2——3 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇溶液；

A3——3 mL蒸餾水+2 mL DPPH·溶液。

（3） ABTS+·清除試驗(yàn)。將 7.4 mmol/L ABTS+·的K2S2O8溶液（K2S2O8濃度為2.6 mmol/L） 在室溫避光保存12 h，制得ABTS+·儲(chǔ)備液。經(jīng)磷酸鹽緩沖液（pH值7.4） 稀釋，使其在波長734 nm處的吸光度達(dá)到0.70±0.02，得到ABTS+·自由基工作液。將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質(zhì)量濃度為20，40，60，80，100 mg/mL，分別取0.2 mL樣品溶液與試管中，加入0.8 mL ABTS+·工作液混合，振搖10 s，以充分混合，暗處反應(yīng)6 min，于波長734 nm處測定吸光度[9]，以相同濃度VE為陽性對照，做3次平行。結(jié)果用ABTS+·清除率表示。

式中：A1——0.8 mL ABTS+·工作液+0.2 mL樣品溶液；

A2——0.8 mL ABTS+·工作液+0.2 mL無水乙醇。

（4）·OH清除試驗(yàn)。將獼猴桃籽油微乳液用無水乙醇分別配制成質(zhì)量濃度為12，16，20，24，28 mg/mL，分別取1 mL上述獼猴桃籽油微乳液于試管中，依次加入濃度為6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，濃度為6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，最后加入濃度為8mmol/L的H2O2溶液1 mL以啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃水浴中加熱30 min后終止反應(yīng)，于波長510 nm測定吸光度A1[10]。以相同濃度VE為陽性對照，臨用前以無水乙醇配制成與試驗(yàn)獼猴桃籽油微乳液同等濃度的對照液。蒸餾水做空白對照，做3次平行。按下式計(jì)算·OH清除率：

式中：A1——1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+

1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液；

A2——1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL無水乙醇溶液；

A3——1 mL蒸餾水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液。

1.3.5 過氧化值測定方法

按照GB 5009.227—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定方法進(jìn)行測定。1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均差±標(biāo)準(zhǔn)差，利用Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃籽油微乳液的氧化穩(wěn)定性

貯藏時(shí)間對獼猴桃籽油微乳過氧化值的影響見圖1。

圖1 貯藏時(shí)間對獼猴桃籽油微乳過氧化值的影響

由圖1可知，在烘箱加速氧化試驗(yàn)中，普通獼猴桃籽油和獼猴桃籽油微乳液的過氧化值均隨貯藏時(shí)間延長而升高，獼猴桃籽油原油增幅為8.71，而獼猴桃籽油微乳液過氧化值的增幅僅為0.15，表明獼猴桃籽油微乳液的抗氧化穩(wěn)定性優(yōu)于普通獼猴桃籽油，與加入的表面活性劑本身具有抗氧化活性有關(guān)[11]。

2.2 獼猴桃籽油微乳液的還原力測定

獼猴籽油微乳還原能力的曲線見圖2。

圖2 獼猴籽油微乳還原能力的曲線

由圖2可知，獼猴桃籽油微乳液和VE還原力均呈線性增長趨勢。根據(jù)還原能力的測定方法，在波長700 nm處測定的吸光度越大，則抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)[12]。還原力強(qiáng)的溶液同時(shí)也是良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子除了Fe3+還原為Fe2+外，也參與自由基反應(yīng)，與自由基結(jié)合生成穩(wěn)定的物質(zhì)。說明在還原力能力上，VE的抗氧化能力高于獼猴桃籽油微乳液。

2.3 獼猴桃籽油微乳液體外抗氧化活性

2.3.1 獼猴桃籽油微乳液對O2-·清除率的影響

O2-·通常作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，可以經(jīng)過一系列反應(yīng)產(chǎn)生其他自由基，進(jìn)一步對機(jī)體造成危害[13]。因此，研究獼猴桃籽油微乳液對O2-·的清除能力是研究其抗氧化活性的重要指標(biāo)。

獼猴桃籽油微乳質(zhì)量濃度對O2-·清除率的影響見圖3。

由圖3可知，獼猴桃籽油微乳液對O2-·的清除能力隨著質(zhì)量其濃度的增加而提高。這是因?yàn)楂J猴桃籽油微乳液中富含多酚類物質(zhì)[14]，可提供氫原子（或正電子），使自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚缘幕蜉^為穩(wěn)定的化合物，從而能中斷自由基的鏈鎖反應(yīng)[15]。當(dāng)質(zhì)量濃度超過12 mg/mL時(shí)，獼猴桃籽油微乳液對O2-·的清除作用趨于平緩，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)87.57%，呈現(xiàn)出良好的O2-·清除能力。

2.3.2 獼猴桃籽油微乳液對清除DPPH·的影響

圖3 獼猴桃籽油微乳質(zhì)量濃度對O2-·清除率的影響

當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子被捕捉而使其顏色變淺，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析，從而評價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。此抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)[16]。

獼猴桃籽油微乳液質(zhì)量濃度對DPPH·清除率的影響見圖4。

圖4 獼猴桃籽油微乳液質(zhì)量濃度對DPPH·清除率的影響

由圖4可知，獼猴桃籽油微乳液和VE均對DDPH·有清除能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)質(zhì)量濃度超過160 mg/mL后，獼猴桃籽油微乳液對DPPH·清除能力比VE的清除能力要高，而DPPH·的清除活性與抗氧化劑分子中有效酚羥基的數(shù)目與新形成的抗氧化劑自由基的穩(wěn)定性有關(guān)[17]。由此推斷獼猴桃籽油微乳液具有良好的DPPH·清除能力。

2.3.3 獼猴桃籽油微乳液對ABTS+·清除率的影響

ABTS+·的清除原理是電子轉(zhuǎn)移過程，并且較DPPH·更容易發(fā)生反應(yīng)。ABTS+·水溶液與過硫酸鉀避光反應(yīng)后，形成深藍(lán)色的ABTS+·儲(chǔ)備液，當(dāng)加入不同質(zhì)量濃度微乳液和VE時(shí)，儲(chǔ)備液顏色變淺，測得吸光度的減少幅度，即為微乳液和VE對自由基的清除率。

獼猴桃籽油微乳液質(zhì)量濃度對ABTS+·清除率的影響見圖5。

圖5 獼猴桃籽油微乳液質(zhì)量濃度對ABTS+·清除率的影響

由圖5可知，在20～100 mg/mL范圍內(nèi)ABTS+·清除率與獼猴桃籽油微乳和VE溶液之間呈良好的線性關(guān)系。因?yàn)榉宇惢衔锏目寡趸钚圆粌H取決于取代基的供電子效應(yīng)，還取決于酚羥基周圍空間位阻[18]。由于VE的側(cè)鏈能夠直接參與到細(xì)胞的氧化還原過程，使得自由基的活力降低。因此，VE清除ABTS+·的能力比較獼猴桃籽油微乳液好。

2.3.4 獼猴桃籽油微乳液對·OH清除率的影響

和其他自由基相比，·OH是體內(nèi)最活躍的活性氧自由基，產(chǎn)生于生命活動(dòng)的氧化代謝過程，可使氨基酸、蛋白質(zhì)、脂類和核酸等大分子發(fā)生氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或使轉(zhuǎn)化細(xì)胞脫離正常細(xì)胞的控制無限生長而癌變[19]。

獼猴桃籽油及其微乳質(zhì)量濃度對·OH清除率的影響見圖6。

圖6 獼猴桃籽油及其微乳質(zhì)量濃度對·OH清除率的影響

由圖6可知，獼猴桃籽油微乳液和VE對·OH的清除能力有所差異，但均表現(xiàn)出了清除能力，并且呈明顯劑量依賴關(guān)系。獼猴桃籽油微乳液對·OH清除率在不同質(zhì)量濃度時(shí)明顯高于VE的清除率，兩值相差40%以上。

3 結(jié)論

（1）獼猴桃籽油微乳液的過氧化值隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸升高，但遠(yuǎn)低于普通獼猴桃籽油，說明獼猴桃籽油微乳液具有較好的抗氧化穩(wěn)定性。

（2）獼猴桃籽油微乳液的體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，獼猴桃籽油微乳液具有一定的還原力和自由基清除能力，其抗氧化能力與其質(zhì)量濃度有較好的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，獼猴桃籽油微乳液對O2-·清除率為87.57%。

（3）獼猴桃籽油微乳液可清除自由基、阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能抑制自由基的氧化損傷，這為獼猴桃籽油微乳液的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了理論依據(jù)，也可為獼猴桃資源的綜合開發(fā)利用提供一條新途徑。