鄧亞軍,解琪琪,李文洲,史衛(wèi)東,馬靖琳,潘云燕,康學(xué)文,汪 靜*

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科,中國甘肅蘭州730030;2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室,中國甘肅蘭州730030;3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,中國甘肅蘭州730030)

miRNAs是—類內(nèi)源性非編碼小RNA,長度一般為21～23個核苷酸[1],在基因表達調(diào)控中具有重要的作用。miRNAs主要通過參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實現(xiàn)對靶基因的表達調(diào)控,在腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物發(fā)育、器官形成、病毒防御、表觀調(diào)控以及代謝等方面都發(fā)揮著重要作用[2]。據(jù)估計,miRNAs占人類基因組的1%～5%[3],高達60%的蛋白質(zhì)編碼基因在轉(zhuǎn)錄后水平受到miRNAs的調(diào)控,其調(diào)控方式主要為抑制mRNAs翻譯或誘導(dǎo)mRNAs降解[4]。

破骨細胞起源于單核髓性造血干細胞[5],是體內(nèi)唯一負責(zé)骨吸收的細胞,其與成骨細胞共同作用,在骨代謝平衡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。許多骨骼疾病的發(fā)生發(fā)展都與破骨細胞有著緊密的聯(lián)系[6],如:破骨細胞活性增強會引起骨吸收增多進而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中破骨細胞是骨侵蝕發(fā)生的關(guān)鍵環(huán),因此研究清楚破骨細胞分化形成的調(diào)節(jié)機制對于解決臨床問題具有重要意義。破骨細胞的分化形成過程受多種細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,近年來研究人員發(fā)現(xiàn)許多miRNAs在破骨細胞分化形成過程起著重要調(diào)控作用,故本文對影響破骨細胞分化形成的相關(guān)miRNAs進行綜述,為后續(xù)相關(guān)研究提供新思路。

1 miRNAs概述

miRNAs是一段由21～23個核苷酸構(gòu)成的高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,其在細胞增殖、分化、代謝及凋亡等不同生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用,是脊椎動物發(fā)育過程中不可或缺的部分[7]。1993年,Lee等[8]首次發(fā)現(xiàn)控制秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)幼蟲發(fā)育的基因lin-4編碼兩個核苷酸長度分別為22和61的小RNA,它們含有與lin-14 mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)互補的序列;與此同時,Wight-man等[9]研究表明 lin-4 RNA 與 lin-14 3′-UTR中的多個位點雜交可以抑制lin-14翻譯而不影響lin-14 mRNA的水平,表明lin-4 RNA在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起重要作用。由于lin-4 RNA的功能在秀麗隱桿線蟲及其他物種中被逐漸發(fā)現(xiàn),因此學(xué)者們就把這一類小調(diào)控RNA稱為 miRNAs[10～11]。

1.1 miRNAs的產(chǎn)生

經(jīng)典的miRNAs成熟途徑如下:miRNAs相關(guān)基因由RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄后形成初級miRNAs(pri-miRNAs),這個時候的miRNAs長達幾千個核苷酸。隨后,微處理復(fù)合物Drosha-DGCR8將pri-miRNAs裂解成前體miRNAs(pre-miRNAs),這時候形成了發(fā)卡結(jié)構(gòu)。以上過程是在核內(nèi)進行的。接著,pre-miRNAs由exportin-5-Ran-GTP復(fù)合物轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中,被RNase Dicer酶分解成長度為21～23個核苷酸的成熟 miRNAs[12]。此時 miRNAs可與 mRNAs的 3′-UTR或其他位點中的互補序列結(jié)合以抑制蛋白質(zhì)翻譯或誘導(dǎo)mRNAs降解[13]。

1.2 miRNAs的作用機制

miRNAs主要通過翻譯抑制及mRNAs降解兩種作用方式在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用[13～14]。miRNAs通過其 5′端的 seed 序列與靶mRNAs的6～7個堿基連續(xù)互補結(jié)合,可導(dǎo)致miRNAs在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制靶基因表達,此種作用方式在哺乳動物中比較普遍[15]。miRNAs也有可能影響mRNAs的穩(wěn)定性,如果miRNAs與靶位點完全互補或者幾乎完全互補,那么這些mi-RNAs的結(jié)合往往會引起靶mRNAs的降解,這種情況在動物、植物中比較常見[16]。通過這種機制作用的miRNAs的結(jié)合位點通常都在mRNAs的編碼區(qū)或開放閱讀框中。一個miRNA可以有多個靶基因,而多個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因[17～18],這種網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系使miRNAs具有更為復(fù)雜的功能。

2 miRNAs與破骨細胞

破骨細胞是體內(nèi)一種負責(zé)骨吸收的骨特異性多核細胞,來源于造血干細胞,其分化受多種細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,其中NF-κB受體激活蛋白配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)是破骨細胞分化的最重要因素[19～21]。此外,有研究表明,破骨細胞前體中miRNAs活性的完全喪失會促進成熟破骨細胞形成[22];另有研究報道,在單核破骨細胞前體和成熟多核破骨細胞中,miRNAs生物合成關(guān)鍵酶的特異性缺失會引起破骨細胞數(shù)量減少和活性降低,進而導(dǎo)致骨量增加[23～24]。由此可知,miRNAs在破骨細胞分化形成過程中發(fā)揮著重要作用。一項小鼠研究表明,從破骨細胞分化的早期到晚期,共有49個miRNAs上調(diào),44個miRNAs下調(diào),同時該研究團隊通過實驗驗證了在破骨細胞分化形成過程中,兩種高度上調(diào)的miRNAs,即miR-365和miR-99b,通過靶向細胞和細胞外基質(zhì)之間的相互作用、軸突導(dǎo)向、黏著斑和肌動蛋白細胞骨架的重塑,調(diào)控成骨細胞分化,由此可以看出多種miRNAs參與破骨細胞分化的調(diào)控[25]。

2.1 促進破骨細胞形成的miRNAs

與破骨細胞形成相關(guān)的miRNAs中,miRNA-21 一直是被廣泛研究的對象[26～27]。Sugatani等[22]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-21在破骨細胞前體中高表達,在破骨細胞分化形成過程中表達水平明顯上調(diào)。轉(zhuǎn)錄因子c-fos和pU.Ⅰ是破骨細胞形成的關(guān)鍵調(diào)控因子,他們通過作用于特定的啟動子觸發(fā)miRNA-21的轉(zhuǎn)錄,與此同時,miRNA-21能夠下調(diào)對c-fos發(fā)揮抑制作用的程序性細胞死亡因子4蛋白(programmed cell death 4,PDCD4)的表達水平。由此可知,c-fos/miRNA-21/PDCD4形成了調(diào)控關(guān)系,共同促進RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞的分化形成[22]。

多項研究表明miRNA-29家族(miRNA-29a-3p,miRNA-29b-3p,miRNA-29c-3p)是調(diào)控破骨細胞形成的關(guān)鍵分子。在來源于骨髓單核細胞(bone marrow monocytes,BMMs)及巨噬細胞系RAW264.7的破骨細胞分化形成過程中,所有miRNA-29家族成員的表達量都升高,當(dāng)他們被敲除后,破骨細胞前體的定型和遷移受到抑制,但并不干擾成熟破骨細胞的功能[28]。Wang等[29]研究表明,miRNA-29家族成員對破骨細胞分化形成的刺激作用主要由靶蛋白核因子I-A(nuclear factor IA,NFIA)轉(zhuǎn)錄后抑制介導(dǎo),其中,NFIA是M-CSF受體的負調(diào)控因子。破骨細胞中的miRNA-29靶蛋白還包括降鈣素受體和關(guān)鍵的細胞骨架組織,例如:細胞分裂控制蛋白42和G蛋白偶聯(lián)受體85[30]。需要指出的是,也有學(xué)者得出與上述相互矛盾的結(jié)論,其研究結(jié)果表明,用pre-miRNA-29a能夠顯著改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠骨量丟失,同時可以抑制miRNA-29在體外增加骨吸收的作用[31～32]。以上研究證據(jù)說明,miRNA-29家族中一部分成員對破骨細胞活性和骨重塑具有較為復(fù)雜的調(diào)控作用。

miRNA-31是與破骨細胞形成相關(guān)的另一個miRNA,其廣泛表達于具有超過200個潛在靶點的多種組織中[32]。有研究表明,miRNA-31在RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞發(fā)生過程中被高度上調(diào),在小鼠骨髓細胞中高達18倍,其特定的miRNA抑制劑能夠抑制終末破骨細胞形成和骨吸收[33],這種作用可能與RhoA的靶向作用有關(guān),RhoA在破骨細胞分化形成中起著關(guān)鍵的成環(huán)作用。此外,其他研究也證實miRNA-31對破骨細胞形成具有促進作用[34]。

在人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)來源的破骨細胞形成過程中,人們通過分析其miRNAs表達譜,證實miRNA-148a對破骨細胞的分化形成具有促進作用,推測這可能是由v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B,MAFB)的負調(diào)控介導(dǎo)[35]。當(dāng)給去卵巢(ovariectomized,OVX)小鼠注射miRNA-148a阻斷劑后,可觀察到骨吸收被抑制,而且骨量增加[35]。

破骨細胞生成的其他正調(diào)控因子還包括mi-RNA-183及miRNA-214。miRNA-183通過抑制血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的表達正調(diào)控破骨細胞的分化形成[36]。Zhao等[37]研究表明,miRNA-214能夠增強破骨細胞活性并降低骨密度,其作用機制可能為miRNA-214通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,Pten)/PI3k/Akt通路對破骨細胞生成進行調(diào)控。

2.2 抑制破骨細胞形成的miRNAs

根據(jù)當(dāng)前的文獻報道可知,miRNA-7-5p、miRNA-26、miRNA-34、miRNA-124、miRNA-125a、miRNA-146a、miRNA-155、miRNA-218-5p 及miRNA-503在破骨細胞形成中表現(xiàn)出抑制作用[38]。miRNA-124和miRNA-218-5p是破骨細胞發(fā)生的主要調(diào)控因子,也可以作為活化T-細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells c1,NFATc1)的內(nèi)源性負調(diào)控因子;miRNA-7-5p和miRNA-26作用于NFATc1上游,通過抑制樹突狀細胞特異性跨膜蛋白(dendritic cell-specific transmembrane protein,DC-STAMP)進而阻止破骨細胞前體融合形成成熟的破骨細胞。Guo等[39]研究指出,在MCSF和RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞發(fā)生過程中,miRNA-125a表達顯著下調(diào),而miRNA-125a過表達時則會抑制破骨細胞的分化形成;相反,通過轉(zhuǎn)染實驗抑制miRNA-125a的表達則促進破骨細胞的發(fā)生過程。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)是RANKL/RANG/NFATc1信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,已被證實是miRNA-125a的作用靶點。體外實驗表明,NFATc1能夠減少miRNA-125a的轉(zhuǎn)錄,從而提示破骨細胞內(nèi)存在TRAF6/NFATc1/miRNA-125a調(diào)節(jié)反饋回路[40]。

此外,干擾素 β (interferon beta,IFN-β)可在RANKL/RANK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)的下游通過cfos依賴性機制在破骨細胞分化期間被誘導(dǎo)產(chǎn)生,并且IFN-β的增加可反過來抑制破骨細胞產(chǎn)生[41]。Zhang等[42]的實驗研究發(fā)現(xiàn),miRNA-155是由IFN-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的miRNA,其通過靶向細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)和小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)這兩種破骨細胞調(diào)控因子,進而介導(dǎo)IFN-β對破骨細胞分化的抑制作用。Nakasa等[43]對mi-RNA-146a在破骨細胞生成中的作用進行了體內(nèi)和體外實驗研究,結(jié)果表明,miRNA-146a能夠抑制M-CSF和RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞的分化形成,而靜脈注射miRNA-146a可在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中防止骨侵蝕。

2.3 破骨細胞相關(guān)的其他miRNAs

在破骨細胞相關(guān)的其他miRNAs中,miRNA-34a在物種間高度保守,并在BMMs及PBMCs來源的破骨細胞分化期間表達下調(diào)[44]。在破骨細胞中特異性表達miRNA-34a的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出骨吸收量減少和骨密度增加,而在miRNA-34a敲除的小鼠模型中觀察到與之相反的表型[45]。此外,采用miRNA-34a納米顆粒治療OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥后,骨質(zhì)疏松癥狀得到有效緩解,這進一步證明miRNA-34a可以成為抑制破骨細胞活性和骨質(zhì)流失的重要目標(biāo)[45]。從分子學(xué)角度來看,由于轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)因子2(transforming growth factor β induced factor homeobox 2,TGIF2)具有促破骨細胞生成的作用,因而被認為是miRNA-34a的直接靶點。與此假說一致,TGIF2缺失可減少骨吸收,而且miRNA-34a會失去對破骨細胞的調(diào)控作用。有研究證明miRNA-503是通過直接抑制RANK而作用于破骨細胞的miRNA[46]。事實上,在OVX小鼠模型中,使用特異性miRNA抑制劑沉默miRNA-503后,RANK蛋白表達量增加,進而促進骨吸收,使骨量減少,而miRNA-503的過表達則會抑制骨吸收,有助于防止骨量丟失。

盡管很多實驗研究都對miRNA-223的功能進行了驗證,但其對破骨細胞的分化形成是促進還是抑制作用仍有爭議[32,47]。miRNA-223幾乎全部在造血系統(tǒng)中表達,包括髓系細胞譜系和單核破骨細胞前體。一些體外研究表明,miRNA-223受轉(zhuǎn)錄因子PU.Ⅰ調(diào)控,其在破骨細胞生成過程中表達量明顯增加,同時也作為對M-CSF刺激的應(yīng)答在破骨細胞前體中表達。Franceschetti等[25]的研究表明,miRNA-223通過抑制核因子I-A(NFIA)的表達,從而增強破骨細胞的分化形成;當(dāng)miRNA-223表達水平受到抑制時,破骨細胞的分化及骨吸收活性降低。然而,與上述結(jié)論相反,另有研究指出,在miRNA-223過表達的情況下,PBMCs及RAW264.7細胞來源的破骨細胞的分化形成被抑制[32,47]。這種效應(yīng)可能通過核因子κB抑制物激酶α(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase-α,IKKα)的下調(diào)介導(dǎo),而IKKα是非經(jīng)典NF-κB信號通路的關(guān)鍵因子。以上研究表明,無論是抑制miRNA-223的表達還是使其過表達,都可能對破骨細胞的形成造成負面影響,因此,適當(dāng)?shù)膍iRNA-223表達量對破骨細胞的發(fā)生顯得尤為重要。

3 展望

骨穩(wěn)態(tài)通過成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收之間的平衡來維持,當(dāng)破骨細胞骨吸收超過成骨細胞骨形成時,會發(fā)生代謝性骨病,例如骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥的治療通常集中于抑制破骨細胞的過度活化,因此,了解破骨細胞分化和成熟的機制將有助于研發(fā)治療骨質(zhì)疏松癥的新方法。破骨細胞的分化成熟過程受到嚴格的調(diào)控,其中miRNAs是調(diào)控因素之一。特異性miRNAs的過表達或抑制能夠有效抑制破骨細胞的分化和骨吸收,基于miRNAs的治療方法為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新思路。然而,由于此治療方法尚未成熟,其在投入臨床應(yīng)用之前,仍面臨著許多嚴峻的問題。例如:miRNAs通過靶向哪些特定途徑來調(diào)控破骨細胞的分化形成？臨床上miRNAs對破骨細胞的調(diào)節(jié)會產(chǎn)生哪些副作用？miRNAs如何在體內(nèi)有效傳遞？這些問題都需要在將來得到解答。