李周勇，王凡，欒少萌，陳建國，康小紅

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，呼和浩特011500）

0 引 言

嗜熱鏈球菌是乳制品行業(yè)最常見的發(fā)酵劑之一，廣泛應(yīng)用于各種發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)[1]。嗜熱鏈球菌菌粉的生產(chǎn)過程中，菌體分離及干燥技術(shù)最為關(guān)鍵[2]。因此，必須選擇合適的離心條件及蛋白溶解劑以提高菌體存活率[3]。冷凍干燥技術(shù)是目前全球范圍內(nèi)乳酸菌保藏使用最廣泛及成熟的技術(shù)[4]。真空冷凍干燥過程中，冷凍速率、菌體濃度、凍干保護(hù)劑、貯存條件等都會對菌體存活率造成顯著影響[5]。本文對不同離心條件、蛋白溶解劑及凍干保護(hù)劑對嗜熱鏈球菌MN 002冷凍干燥的效果進(jìn)行了研究，通過比較離心前后活菌數(shù)的變化及菌體存活率[6]，篩選出嗜熱鏈球菌MN 002最佳的離心條件及凍干保護(hù)劑組合，為嗜熱鏈球菌MN 002凍干菌粉的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

菌種：嗜熱鏈球菌MN 002（蒙牛自主知識產(chǎn)權(quán)菌種庫保藏菌株，使用超低溫冰箱于-80℃保存）。

試劑：脫脂乳粉（雀巢）、蔗糖、乳糖、海藻糖、麥牙糖、糊精、抗壞血酸、甘油醇、吐溫80、甘油、蛋黃粉、谷氨酸鈉、氫氧化鈉、六偏磷酸鈉、檸檬酸鈉、MC瓊脂培養(yǎng)基，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備

DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱，武漢科輝；ALPHA 1-4 LD plus真空冷凍干燥機(jī)，德國christ公司；Bio-StatB生物發(fā)酵罐，德國貝朗公司；G560E漩渦混合器，美國SCIENTIFIC Instruments公司；Premium U 410超低溫冰箱，美國NBS公司；PB-10 pH計(jì)，北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī)，日立公司；ML51生物顯微鏡，日本Olympus；ACB-6A1超凈工作臺，新加坡ESCO公司。

1.3 方法

1.3.1 凍干菌粉制備工藝[7]

菌種高密度培養(yǎng)→菌體離心富集→加入凍干保護(hù)劑→預(yù)凍處理→真空冷凍干燥

1.3.2 離心條件的控制

用無菌吸管將最優(yōu)條件下培養(yǎng)的嗜熱鏈球菌MN 002培養(yǎng)物移入滅菌離心管中，上機(jī)離心，固定離心時(shí)間為5 min[8]，以菌體離心存活率及發(fā)酵液菌體離心濃縮倍數(shù)為指標(biāo)[9]，對離心轉(zhuǎn)數(shù)和溫度進(jìn)行篩選。測定離心前發(fā)酵液中活菌數(shù)記為離心前活菌數(shù)，離心后迅速棄上清，加入滅菌生理鹽水至離心前體積，測得離心后沉降菌體活菌數(shù)。

菌體離心存活率=離心后沉降菌體活菌數(shù)/初始發(fā)酵液活菌數(shù)×100%，

菌體離心濃縮倍數(shù)X=W/（W-W 1），

式中：W為測量時(shí)所取的10 g發(fā)酵菌液；W 1為發(fā)酵菌液經(jīng)轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min所得的上清液質(zhì)量。

1.3.3 蛋白洗脫液配方優(yōu)化[10]

選取蛋白洗脫劑六偏磷酸鈉和檸檬酸鈉[11]，單獨(dú)和混合復(fù)配使用。蛋白洗脫劑預(yù)先用少量蒸餾水溶解，再按濃度要求添加到增菌結(jié)束后的菌體培養(yǎng)液中混合均勻，20℃保持60 min[12]，在最優(yōu)離心條件下離心，按1.3.2的方法測定菌體濃縮倍數(shù)。

1.3.4 凍干保護(hù)劑單因素篩選

嗜熱鏈球菌MN 002的凍干懸浮基質(zhì)采用15%的脫脂乳[13]，按表1分別加入不同種類和濃度的保護(hù)因子，在100 mL三角燒瓶中充分混合并滅菌。按離心后的菌體2倍量充分混合制成菌體懸浮液，取1 mL菌體冷凍懸浮液移入西林瓶中，在凍干機(jī)中真空凍干，測定凍干后菌體的存活率[14]。

表1不同凍干保護(hù)因子的種類和添加量

1.3.5 復(fù)合凍干保護(hù)劑二次旋轉(zhuǎn)正交優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取其中5種對菌體存活率有顯著影響的保護(hù)劑，以10%脫脂乳為基礎(chǔ)物質(zhì)[15]，運(yùn)用五因素二次旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)優(yōu)化嗜熱鏈球菌MN 002保護(hù)劑配方。實(shí)驗(yàn)因素水平編碼如表2所示。

表2實(shí)驗(yàn)因素水平編碼 %

1.3.6 其他指標(biāo)測定方法

（1）活菌數(shù)測定[16]

按GB4789.35采用MC瓊脂培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌MN 002進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)（37℃需氧培養(yǎng)72 h，記錄菌落數(shù)）。

（2）凍干存活率

使用生理鹽水適當(dāng)稀釋凍干菌，MC瓊脂培養(yǎng)基傾注平板，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)，其凍干存活率為

凍干存活率=凍干后活菌數(shù)/凍干前活菌數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 離心條件的選擇

固定離心時(shí)間為5 min，在不同離心轉(zhuǎn)數(shù)及溫度條件下，菌體離心存活率及離心濃縮倍數(shù)如表3所示。

表3不同離心條件下嗜熱鏈球菌MN002的離心效果

由表3可以看出，在轉(zhuǎn)速為8 000 r/min的高分離轉(zhuǎn)速條件下，4℃低溫組的存活率為80.0%，顯著高于25℃室溫組的48.3%(p＜0.01)；在4℃低溫條件下，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min高分離轉(zhuǎn)數(shù)的存活率同樣顯著高于低分離轉(zhuǎn)數(shù)的活率(p＜0.01)。因此離心法濃縮菌體采用低溫和高分離轉(zhuǎn)數(shù)對菌數(shù)存活比較有利，這與胡仲秋等的研究結(jié)果一致[17]。實(shí)驗(yàn)最終確定最佳離心條件為，離心轉(zhuǎn)速8000r/min，離心溫度4℃。

通過表3中的數(shù)據(jù)還可以看到，各實(shí)驗(yàn)組菌體濃縮倍數(shù)均不是太高，分析原因，可能是在濃縮物中，由于嗜熱鏈球菌MN002產(chǎn)酸使得部分蛋白沉淀，并隨同菌體一起離心分離，這在很大程度上降低了離心效果[18]。因此，實(shí)驗(yàn)下一步將對蛋白溶解劑進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最優(yōu)的菌體濃縮效果。

2.2 蛋白洗脫液配方優(yōu)化結(jié)果

增菌發(fā)酵過程中乳蛋白發(fā)生一定程度變性，使離心沉淀物中伴隨有大量乳蛋白質(zhì)，菌體濃縮倍數(shù)受到限制，為此選擇蛋白洗脫劑六偏磷酸鈉和檸檬酸鈉[19]，并將其單獨(dú)和復(fù)配添加到增菌結(jié)束后的菌體培養(yǎng)液中，20℃保持60min后，于4℃條件下，轉(zhuǎn)速為8000 r/min離心處理5min，菌體濃縮倍數(shù)測定結(jié)果如表4所示。

表4添加復(fù)合鹽類的菌體離心濃縮倍數(shù)

由表4可以看出，蛋白洗脫液的加入大大提高了菌體濃縮倍數(shù)，且將蛋白洗脫劑六偏磷酸鈉和檸檬酸鈉復(fù)配使用的效果明顯優(yōu)于洗脫劑單獨(dú)作用，以第四組實(shí)驗(yàn)中的0.15%六偏磷酸鈉和0.5%檸檬酸鈉配合及第五組實(shí)驗(yàn)中的0.20%六偏磷酸鈉和0.5%檸檬酸鈉復(fù)配洗脫效果最好，考慮到生產(chǎn)成本，最終我們選擇0.15%六偏磷酸鈉和0.5%檸檬酸鈉復(fù)配，作為最佳的蛋白洗脫液組合。

2.3 凍干保護(hù)劑單因素篩選結(jié)果

菌體冷凍干燥后的存活率受多種因素的影響，而保護(hù)介質(zhì)是其中重要的影響因素，良好的保護(hù)劑要求其在凍干過程中能提供菌體保護(hù)作用，降低菌體死亡，同時(shí)能有較好的自身穩(wěn)定性且有利于再水合，還可方便有效的除去凍干材料中的多余溶劑[20]。試驗(yàn)以15%的脫脂乳為對照，對嗜熱鏈球菌冷凍干燥保護(hù)效果較好的大分子、鹽類、糖類及單分子等多種保護(hù)劑進(jìn)行了研究，以篩選適合嗜熱鏈球菌MN002的凍干保護(hù)劑。

由表5可以看出，除蛋黃由于凍干后與菌體粘在一起，十分黏稠未能檢出，其它所選保護(hù)劑對嗜熱鏈球菌均有一定的保護(hù)效果。其中甘油醇、吐溫80、糊精對菌體凍干保護(hù)作用相當(dāng)(p＞0.05)，對菌體存活率提高較少。海藻糖、抗壞血酸、甘油及谷氨酸鈉對菌體凍干保護(hù)作用相當(dāng)(p＞0.05)，對菌體存活率提高最大。海藻糖與甘油是應(yīng)用較為廣泛的凍干保護(hù)劑[21]，在本試驗(yàn)中它們的效果較好。許多研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸鈉可以提高大多數(shù)乳酸菌冷凍和冷凍干燥的存活率，這與本研究結(jié)果一致，這是因?yàn)楣劝彼徕c氨基基團(tuán)與微生物蛋白質(zhì)的羥基基團(tuán)之間的反應(yīng)穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，且保留了較大的水分含量[22]。蔗糖、乳糖、麥芽糖效果相當(dāng)(p＞0.05)，對菌體存活率提高較大，從應(yīng)用范圍及成本考慮，選取蔗糖作為其中一個(gè)主要保護(hù)因子。因此，我們最終選擇蔗糖、海藻糖、抗壞血酸、甘油及谷氨酸鈉作為主要影響因子，進(jìn)行下一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表5嗜熱鏈球菌MN002凍干保護(hù)劑單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 復(fù)合凍干保護(hù)劑優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取蔗糖、海藻糖、抗壞血酸、甘油及谷氨酸鈉作為保護(hù)劑組分，按表2的水平設(shè)置，采用二次旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對嗜熱鏈球菌MN002的復(fù)合凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化，凍干后嗜熱鏈球菌MN002存活率如表6所示。

2.4.1 保護(hù)劑模型及分析

以嗜熱鏈球菌MN002菌體存活率（Y）為響應(yīng)值，采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到多元二次回歸模型如下：

式中：x1，x2，x3，x4，x5分別為蔗糖、甘油、谷氨酸鈉、抗壞血酸、海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的編碼值。

由表7可以看出：F1=0.2987＜F0.05(6，9)=3.69，F(xiàn)2=17.4351＞F0.01(20，15)=3.37。F1檢驗(yàn)通過，說明二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)所選擇的5個(gè)因素（蔗糖濃度、甘油濃度、谷氨酸鈉濃度、抗壞血酸濃度、海藻糖濃度）是最主要因素，并無其他主要因素，實(shí)際規(guī)律滿足二次方程條件，無更高次項(xiàng)的干擾。F2檢驗(yàn)通過說明回歸模型是顯著的，與實(shí)際情況擬和的較好。

利用t檢驗(yàn)在ɑ=0.01顯著水平對模型中各回歸系數(shù)進(jìn)行有效性檢驗(yàn)，剔除不顯著項(xiàng)后，模型（1）回歸方程可簡化為

Y=0.8430-0.0653x12-0.0654x22+0.0064x3-0.0723x32+0.0072x4-0.0658x42+0.0060x5-0.0683x52， （2）

表6二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7方差分析結(jié)果

各因素對指標(biāo)值的貢獻(xiàn)率為x1=5%，x2=2%，x3=0.8%，x4=1%，x5=5%；x3(0.9872)＞x5(0.9864)＞x4(0.9853)＞x1(0.9843)＞x2(0.9837)，即谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.4.2 單因素分析

將模型中的4個(gè)因素分別固定在（-2，-2）、（0，0）、（2，2）的水平上，對第5個(gè)因素進(jìn)行單因素分析，得到5個(gè)因素分析結(jié)果如下圖1-圖5所示。

圖1蔗糖對MN002的保護(hù)作用

圖2甘油對MN002的保護(hù)作用

圖3谷氨酸鈉對MN002的保護(hù)作用圖

圖4抗壞血酸對MN002的保護(hù)作用

圖5海藻糖對MN002的保護(hù)作用

由圖1-圖5可以看出，每種保護(hù)劑對凍干存活率的單因素影響趨勢基本一致，均為拋物線關(guān)系，MN 002存活率隨各保護(hù)劑濃度的增加先增加至某一極值點(diǎn)后又開始下降。每組曲線中曲線2的值均高于曲線1和曲線3，這說明5種保護(hù)劑單獨(dú)作用時(shí)，其他4種保護(hù)劑在零水平附近利于其保護(hù)作用的發(fā)揮。

2.4.3 雙因素分析

將模型B中每三個(gè)因素一組，固定在零水平，就可得到另外二個(gè)因素對凍干存活率影響的子模型，根據(jù)該子模型，可分別繪制每兩因素協(xié)同作用對存活率影響的曲面圖。本研究為五因素旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，因此可得 10個(gè)子模型和相應(yīng)10組曲面圖，如圖6所示。

圖6兩因素協(xié)同作用對MN002存活率的影響

由圖6可以看出，保護(hù)劑兩因素協(xié)同作用對MN 002凍干存活率的影響具有很大相似性。每組曲面的影響趨勢均表現(xiàn)為：當(dāng)因素1為固定水平時(shí)，指標(biāo)值隨因素2的增加而增加，增加至某一值后，又隨因素2的增加而降低，當(dāng)因素2為固定水平時(shí)，因素1的變化趨勢也是如此，只是部分曲面的走勢略有不同。例如以圖6（a）為代表，蔗糖與甘油協(xié)同作用時(shí)，MN 002凍干存活率升降趨勢較明顯，以圖6（e）為代表，甘油與谷氨酸鈉協(xié)同作用時(shí)，MN 002凍干存活率升降趨勢較平緩。兩因素均取適中值時(shí)，容易獲得較大存活率，這與單因素分析的情況對應(yīng)。另外，從圖6（a-d）比較可知，已知較為有效的保護(hù)劑蔗糖與其它滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑之間的協(xié)同作用區(qū)別不大，從圖6（c）可見蔗糖與抗壞血酸鈉的協(xié)同作用較好。

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過回歸模型方程式求Y極值，可得在本試驗(yàn)條件下，菌體存活率的理論極值F max=84.8%，此時(shí)最佳保護(hù)劑組合為x1=5%，x2=2%，x 3=0.8%，x 4=1%，x5=5%；即蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%，抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。在實(shí)驗(yàn)所得最佳條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，MN 002菌體存活率可達(dá)84.2%，與理論極值接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了保護(hù)劑模型的合理性。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)對不同離心條件下嗜熱鏈球菌MN 002的存活率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在離心轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，離心溫度4℃條件下，菌體離心存活率最高。同時(shí)，以菌體濃縮倍數(shù)為指標(biāo)，對蛋白洗脫劑進(jìn)行了組合研究，發(fā)現(xiàn)0.15%六偏磷酸鈉和0.5%檸檬酸鈉配合使用效果最好，可大大提高M(jìn)N 002菌體濃縮倍數(shù)。

以嗜熱鏈球菌MN 002凍干存活率為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，建立了凍干存活率與蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)、谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的回歸模型，該模型與實(shí)際擬合性好，能有效反映實(shí)際情況。通過對回歸方程進(jìn)行分析，得到了最佳的菌體凍干保護(hù)劑組合：蔗糖為5%，甘油為2%，谷氨酸鈉為0.8%，抗壞血酸為1%，海藻糖為5%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），MN 002菌體存活率的理論極值為84.8%。各因素對菌體存活率的影響大小為谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)。