麻志寧，王媛媛，李紅娟，李洪波，于景華

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.梅花生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北廊坊065000）

0 引 言

乳清蛋白是脫脂乳粉的優(yōu)質(zhì)蛋白，不僅影響脫脂乳粉的營養(yǎng)價值，也與脫脂粉的多種應(yīng)用特性有關(guān)。它通常由球狀蛋白質(zhì)組成，β-乳球蛋白(β-Lg)，α-乳白蛋白(α-La)和牛血清白蛋白（BSA）是乳清蛋白中的主要蛋白質(zhì)[1]。預(yù)熱一般為脫脂乳粉加工的關(guān)鍵階段，在殺菌加熱條件下，乳清蛋白易發(fā)生變性和聚合，對乳清蛋白天然狀態(tài)和穩(wěn)定性會產(chǎn)生顯著影響[2-3]。相比之下，酪蛋白熱穩(wěn)定性較高，在加熱處理的常規(guī)條件下一般不產(chǎn)生變性[4]，但當(dāng)加熱溫度達(dá)到某種程度也與變性的乳清蛋白產(chǎn)生聚合，聚合物主要分成：（1）β-Lg與酪蛋白的聚集物，主要是β-Lg-κ-酪蛋白復(fù)合物[5]；（2）隨著加熱溫度升高，變性的α-La附 著在β-Lg-酪蛋白表面使其進(jìn)入膠束相[6]；（3）通過對牛乳的加熱，因乳清蛋白中包含的二硫鍵和巰基，導(dǎo)致β-乳球蛋白的疏水基團(tuán)暴露，發(fā)生巰基與二硫鍵的交換，而α-La隨著不斷地加熱也發(fā)生變性，乳清蛋白在低溫變性過程中α-La通過與β-Lg發(fā)生聚合間接與酪蛋白膠束結(jié)合，形成可溶性聚合物[7]。

近年來一些專家主要針對溫度、p H[8-9]等對乳清蛋白變性的影響做了深入探討，而酪蛋白作為乳中重要基質(zhì)也對乳清蛋白的變性有一定作用，了解在低溫下酪蛋白對乳清蛋白的影響可以在不同時間、溫度下調(diào)節(jié)酪蛋白與乳清蛋白組間的熱誘導(dǎo)聚合作用，朝著有利于乳粉加工特性的方向發(fā)展。新鮮牛乳在35℃左右離心去除脂肪得到脫脂乳。而將脫脂乳中酪蛋白沉淀離心后進(jìn)行調(diào)酸調(diào)堿得到乳清上清液。將兩種體系在一定條件下進(jìn)行對比能夠突出酪蛋白對乳清蛋白變性的作用。以往研究的樣品多為脫脂乳、乳粉[10-11]等對比研究如此得到的檢測結(jié)果不能完全反應(yīng)乳清蛋白熱變性及酪蛋白與乳清蛋白聚合情況。本研究以新鮮脫脂牛乳為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)材料，采用反相高效液相色譜法定量檢測加熱脫脂乳體系與乳清體系中未變性BSA、α-La、β-Lg的含量，通過探究乳清蛋白組間的相關(guān)性，了解低熱脫脂乳粉關(guān)鍵溫度的控制范圍，研究乳清蛋白熱變性趨勢及酪蛋白對乳清蛋白變性影響大小，以及為乳粉的生產(chǎn)和使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛奶（購于天津奶廠），預(yù)先離心除脂，5℃冷藏備用；三氟乙酸（色譜純 天津賽孚瑞科技有限公司）；乙腈（色譜純博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司）；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-N電子天平上海METTLER TOLEDO集團(tuán)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋上海-恒科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；FE20Mettler pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；L2000高效液相色譜儀日本島津公司；色譜柱（Venusil ASB-C8（250 mm×4.6 mm，5μm，300?）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂乳樣品的制備

將脫脂乳分裝在5個250 mL燒杯中分別水浴加熱到55、65、75、85、95℃。5個樣品在其對應(yīng)加熱溫度下保持1、5、10、20、30 min，循環(huán)冰水浴中迅速自動冷卻，然后用0.1 mol/L的HCl溶液沉淀酪蛋白和變性的蛋白質(zhì)，直至溶液pH值調(diào)節(jié)至4.6達(dá)到沉淀終點(diǎn)。經(jīng)6 500 g離心，取上清液過0.22μm濾膜，制成待檢測樣品。

1.3.2 乳清上清液的制備

脫脂乳用1 mol/L的HCl將p H值調(diào)節(jié)至4.6，沉淀酪蛋白，經(jīng)6 500 g離心30 min后取上清液，用1 mol的NaOH溶液調(diào)節(jié)p H值至6.6～6.7，再將收集的乳清上清液按照1.3.1方法進(jìn)行加熱處理，檢測結(jié)果與加熱脫脂乳樣品進(jìn)行對比。

1.3.3 液相檢測條件

液相條件：本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法分離并測定未變性的乳清蛋白的含量，實(shí)驗(yàn)用色譜柱為Venusil ASB-C8（250 mm×4.6 mm，5μm，300?）；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10μL；檢測波長為215 nm；柱溫30℃；洗脫時間25 min；流動相A：0.1%的三氟乙酸水溶液；流動相B：0.1%的三氟乙酸乙腈溶液；采用梯度洗脫方式。

梯度洗脫：流動相B初始比例20%（流動相A為80%）在20 min內(nèi)上升到80%（變化率為3%），然后在80%下等梯度洗脫6 min，最后1 min內(nèi)降到20%，洗脫時間27 min。

1.3.4 BSA、α-La、β-Lg變性率的計算

根據(jù)所檢測的未加熱鮮脫脂奶和加熱脫脂奶中檢測到的蛋白含量，計算蛋白變性率。

蛋白變性率=（未加熱樣品中蛋白含量－加熱樣中蛋白含量）/未加熱樣中蛋白含量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 在乳清體系及脫脂乳體系中乳清蛋白主要組分對乳清蛋白熱變性的影響

通過RP-HPLC方法分析脫脂乳在不同加熱溫度和加熱時間下，乳清蛋白主要組分BSA、α-La、β-Lg的熱變性率，并與同樣處理的乳清體系中乳清蛋白的熱變性率做比較分析，以評估乳清蛋白主要組分對乳清蛋白熱變性的影響。

2.1.1 BSA對乳清蛋白熱變性的影響

圖1為不同加熱溫度（55～95℃）和不同加熱時間（1～30 min）下，脫脂乳體系和乳清體系BSA的變性率比較結(jié)果。

如圖1可得，在不同加熱條件下，脫脂乳體系與乳清體系中BSA熱變性趨勢大致相同，當(dāng)溫度達(dá)到65℃時BSA變性顯著，伴隨著65～85℃加熱溫度的逐步升高，存在時間累積效應(yīng)，即隨著加熱時間的增長，BSA變性率劇增，85～95℃幾乎迅速全部變性。主要由于在加熱溫度達(dá)到60℃或以上時，BSA分子結(jié)構(gòu)中自由巰基的顯露致使BSA單體的穩(wěn)定性減弱，分子結(jié)構(gòu)打開生成聚合物[12]。BSA分子中的自由巰基能導(dǎo)致本身變化[13]，溫度的逐步升高使裸露的巰基發(fā)生巰基-二硫鍵的交換并且通過疏水作用本身產(chǎn)生聚合，最后生成凝膠。脫脂乳體系中酪蛋白幾乎不對乳清蛋白變性產(chǎn)生影響，而BSA本身一般不會與酪蛋白產(chǎn)生聚集反應(yīng)。Kang等[14]人猜想BSA也許與蛋白質(zhì)間分子動力學(xué)不符，即BSA持續(xù)保留著不完整體形態(tài)，聚集反應(yīng)不明顯。BSA不僅可以利用本身聚集生成聚集物，而且能依靠二硫鍵與α-乳白蛋白生成少量可以溶解的聚集物。Hines等[15]人研究顯示，BSA的聚合量與β-Lg關(guān)系不大。由此BSA也不可能依靠α-乳白蛋白與β-乳鐵蛋白和酪蛋白生成不可溶解的聚集物，因此在含有一定乳清蛋白的牛乳狀態(tài)中，BSA的變性趨向不可能呈現(xiàn)明顯差別。

2.1.2 α-La對乳清蛋白熱變性的影響

圖1不同加熱溫度與加熱時間下，脫脂乳體系與乳清體系中BSA的變性率

圖2為不同加熱溫度（55～95℃）和不同加熱時間（1～30 min）下，脫脂乳體系和乳清體系中α-La的變性率比較結(jié)果。

從圖2可以看出65～95℃加熱溫度下，α-La的變性率隨加熱時間的延長而平穩(wěn)增加。隨著溫度的不斷升高，α-La打開了分子內(nèi)二硫鍵通過疏基二硫鍵交換反應(yīng)產(chǎn)生聚集[16]。溫度低于75℃時，在加熱脫脂乳體系與乳清體系中的α-La變性率差異較小，而在75～95℃的加熱范圍內(nèi)變性率區(qū)別明顯。α-La不含有游離巰基，不會出現(xiàn)自聚合反應(yīng)，在加熱溫度低于75℃時，脫脂乳體系與乳清體系中的α-La大部分都只發(fā)生空間結(jié)構(gòu)變化，在此溫度之間，使得在乳清蛋白聚合中起主導(dǎo)作用的β-Lg沒有發(fā)生大量變性[17]，不能提供游離巰基，而BSA加熱后發(fā)生的自聚現(xiàn)象，使單體BSA的量降低[18]，α-乳白蛋白運(yùn)用極小量的BSA供給的巰基與之發(fā)生聚合，但BSA自身含量較低，兩者生成的復(fù)合物含量低微，聚合度不大，幾乎不與酪蛋白聚合。加熱溫度高于75℃，特別是85℃左右時，脫脂乳體系與乳清體系中的α-乳白蛋白變性率差異趨于顯著，或許是脫脂乳體系中β-乳鐵蛋白的球狀蛋白結(jié)構(gòu)破壞失去穩(wěn)定，α-乳白蛋白利用β-乳鐵蛋白游離出的巰基參加與酪蛋白膠束的反應(yīng)，α-乳白蛋白與酪蛋白聚集量逐漸增多，結(jié)合的α-La-β-Lg也與酪蛋白聚集，因而使α-La變性速度增快。95℃時脫脂乳體系與乳清體系中α-乳白蛋白變性率差異較小，乳清體系中原來被保存下來的α-乳白蛋白由于加熱溫度較高，加熱時間太長而全都發(fā)生變性，并與乳清蛋白中的其它蛋白組分產(chǎn)成聚集物。

圖2不同加熱溫度與加熱時間下，脫脂乳體系與乳清體系中α-La的變性率

2.1.3 β-Lg對乳清蛋白熱變性的影響

圖3為不同加熱溫度（55～95℃）和不同加熱時間（1～30 min）下，脫脂乳體系和乳清體系中β-Lg的變性率比較結(jié)果。

由圖3可以看出，在加熱溫度為75～85℃時，脫脂乳體系與乳清體系中的β-Lg變性程度有明顯差別。溫度升高，β-Lg空間構(gòu)象產(chǎn)生變化，巰基發(fā)生暴露，聚合量逐漸增多，但因酪蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，自身很難發(fā)生變性[19]。當(dāng)溫度達(dá)到80℃以上時，β-Lg變性率激增，脫脂乳體系中酪蛋白產(chǎn)生解離，覆蓋在酪蛋白膠束表面的κ-CN會與己變性的β-Lg產(chǎn)生反應(yīng)。對脫脂牛奶進(jìn)行加熱過程中，β-Lg的兩個二硫鍵和一個巰基在與κ-CN反應(yīng)中起到重要作用，κ-CN分子中含有2個巰基（-SH），受熱形成二硫鍵（-S-S-），與變性的β-Lg分子中游離巰基發(fā)生分子間巰基-二硫鍵反應(yīng)，形成κ-CN/β-Lg復(fù)合物質(zhì)凝聚在酪蛋白膠束表面[20]，同時在加熱溫度不斷升高的情況下不止是通過改變分子的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生聚合反應(yīng)，也可能是分子間的無規(guī)則布朗運(yùn)動加劇，分子間的碰撞提高而促進(jìn)聚合物的生成[21]。在脫脂奶中還有一些含量較低的乳鐵蛋白和αs2-酪蛋白中含有的二硫鍵也可以與巰基產(chǎn)生交互作用形成熱誘導(dǎo)聚集體[22]。

乳清體系中缺少酪蛋白，當(dāng)加熱溫度低于75℃時，乳清蛋白變性率較低，其自身不會產(chǎn)生很大程度變性，85℃脫脂乳中部分變性的β-Lg與κ-酪蛋白聚合，在較高的溫度下蛋白分子間疏水相互作用的增加也進(jìn)一步促進(jìn)反應(yīng)向蛋白變性的方向進(jìn)行[23]。由于加熱溫度的持續(xù)升高，乳清蛋白組分間產(chǎn)生的游離巰基繼續(xù)促進(jìn)變性蛋白通過巰基-二硫鍵交換聚合·成高聚物，直到最后β-Lg實(shí)現(xiàn)完全變性。

在β-Lg變性過程中，乳清體系中產(chǎn)生的鹽離子也可能影響β-Lg的變性程度。鹽離子濃度的增加使蛋白質(zhì)的電荷分布發(fā)生變化，β-乳球蛋白以非共價鍵的形式存在且形成的聚合物一般為低聚體[24]。NaCI具有鹽析作用，當(dāng)鹽離子濃度較高時，它能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，使β-Lg的變性速率減慢。高濃度鹽離子還能夠加快蛋白的聚合。當(dāng)鹽離子濃度較低時，蛋白的表面特性發(fā)生改變，物理化學(xué)聚集速度提高，聚集物增大[25-26]。Nicorescu[27]發(fā)現(xiàn)在WPI溶液中加入NaCI溶液，有利于蛋白質(zhì)單體和二聚體的鹽析聚集，促進(jìn)可溶性聚合物含量增加，乳清蛋白溶液的表面張力降低。Aymard[28]等研究發(fā)現(xiàn)在鹽離子濃度增大的過程中，β-乳球蛋白中單體和二聚體失去了平衡，二聚體含量逐步增多。由此推測出由于加入的鹽離子使蛋白分子產(chǎn)生靜電排斥，所帶電荷進(jìn)行重新分布。所以鹽離子濃度可能會影響β-乳球蛋白的聚集程度，進(jìn)而影響變性速率。

從脫脂乳體系與乳清體系中3種蛋白熱變性率對比趨勢圖能夠得出，酪蛋白對BSA熱變性影響不大，而一定程度上在65～95℃之間促進(jìn)了α-La和β-Lg的熱變性，但蛋白的最終變性趨勢相同，即趨向全部變性。因此酪蛋白的缺失不會對乳清蛋白的最終變性產(chǎn)生很大影響，只是減緩了乳清蛋白的聚合速度，并沒有使乳清蛋白在95℃加熱下的最終變性程度下降。

圖3不同加熱溫度與加熱時間下，脫脂乳體系與乳清體系中β-Lg的變性率

3 結(jié) 論

對比乳清體系與脫脂乳體系中BSA、α-La和β-Lg的熱變性情況分析顯示BSA在脫脂乳體系與乳清體系中變性趨勢基本相同，α-La的變性率在75～95℃的加熱范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定差量，而β-Lg在75～85℃加熱范圍內(nèi)變性率有明顯差異。

3種蛋白的熱變性率具有明顯的溫度與時間累積效應(yīng)，BSA的熱變性激增區(qū)間為55～85℃，β-Lg為65～75℃，而α-La的熱變性率則在65～95℃間隨加熱時間和加熱溫度的升高而平穩(wěn)增加，三種蛋白熱穩(wěn)定性大小順序?yàn)椋害?La＞β-Lg＞BSA。乳清體系中產(chǎn)生的鹽離子在一定程度能夠增強(qiáng)溶液中的離子強(qiáng)度，對β-乳球蛋白的變性可能會產(chǎn)生一定影響。

通過對兩種體系中BSA、α-La和β-Lg的熱變性比較表明酪蛋白對BSA的熱變性幾乎沒有影響，而對65～95℃間α-La和β-Lg的熱變性有一定的促進(jìn)作用，能夠加速乳清蛋白之間的誘導(dǎo)聚合反應(yīng)。缺乏酪蛋白，乳清蛋白的聚合速度減緩，而95℃的最終變性率基本相同。

本文對脫脂乳體系和乳清體系中的乳清蛋白主要組分在不同條件下進(jìn)行了比較分析，在低溫下了解了乳清蛋白主要組分的變性情況，而在高溫狀態(tài)下兩種體系中乳清蛋白主要組分的變化需進(jìn)一步研究。在實(shí)際生產(chǎn)中的壓力、p H、離子強(qiáng)度等因素也可能會影響蛋白變性情況，需要更深入進(jìn)行全面系統(tǒng)研究。進(jìn)一步了解脫脂乳體系和乳清體系中的蛋白變性情況更有利于實(shí)際生產(chǎn)中的加工運(yùn)用。