姚瀚勛，李曉斌，邱 晟，王 勇，王文波

(1.浙江省湖州市中心醫(yī)院/浙江大學(xué)湖州醫(yī)院神經(jīng)外科 313000；2.桂林醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西桂林 541001；3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西桂林 541001)

毛蕊異黃酮是來源于黃芪的一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、類雌激素等作用[1-2]。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮具有體外抗氧化的作用[3]。本研究通過建立局灶性腦缺性再灌注的大鼠模型，探討毛蕊異黃酮的體內(nèi)抗氧化作用及神經(jīng)保護的分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 3月齡SD雌性大鼠100只，SPF級，體質(zhì)量225～275 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(桂)2013-0006。毛蕊異黃酮，溶劑為0.1 mol/L 二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO，生產(chǎn)批號：20140720)，由天津馬克生物技術(shù)有限公司提供?？偟鞍?TP)測定試劑盒(生產(chǎn)批號:20140118)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(生產(chǎn)批號：20140117)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(生產(chǎn)批號：20140109)由南京建成生物工程研究所提供。TRIzol 試劑，cDNA 第一鏈合成試劑盒由美國Thermo Fisher公司提供。Real time PCR Master Mix由日本Toyobo公司提供。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、提取試劑盒、引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。兔源磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)p65單抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗鼠IgG和GAPDH抗體由Santa Cruz提供。4%多聚甲醛、DAB顯色試劑盒、蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、硝酸纖維素(NC)膜、氯化三苯四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)10 g/瓶(生產(chǎn)批號：080414)由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1分組并建立模型 大鼠分成5組，每組20只：缺血再灌注組(模型組)，毛蕊異黃酮高(20 mg/kg)、中(10 mg/kg)、低(5 mg/kg)劑量組，假手術(shù)組。灌胃給藥，每天上、下午各1次，連續(xù)給藥14 d。模型組和假手術(shù)組灌等量DMSO。末次給藥1 h后，除假手術(shù)組不制備栓塞外，其余各組采用大腦中動脈線栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。若大鼠清醒后出現(xiàn)以下4種表現(xiàn)時，(1)左側(cè)Horner征陽性；(2)右側(cè)前肢癱瘓；(3)提起鼠尾后不能伸右前肢；(4)右旋時右前肢拖在腹下，與左前肢交叉成剪刀狀，則表明模型制作成功。

1.2.2神經(jīng)行為學(xué)檢查 于給藥前及處死前進行Bederson′s評分：行為都正常記0分；提鼠尾離地約1尺，手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收記1分；推大鼠雙肩，手術(shù)對側(cè)抗力下降記2分；觀察大鼠在水平面行走情況，圍繞健側(cè)轉(zhuǎn)圈記3分；不能自主活動記4分。分數(shù)越高說明神經(jīng)損傷越嚴重。

1.2.3腦梗死體積測定 腦缺血2 h后拔除線栓，恢復(fù)再灌注24 h后斷頭取腦，從視交叉起作2 mm層厚冠狀切片，將腦片放入2% TTC磷酸鹽緩沖液中37 ℃恒溫避光孵育30 min，正常腦組織呈現(xiàn)紅色，梗死腦組織呈現(xiàn)白色。腦片排列整齊并拍照，使用圖像分析軟件處理，計算每張腦片的梗死面積，乘以厚度2 mm再相加即為腦梗死體積。

1.2.4腦組織含水量測定 采用干濕法，腦組織含水量(%)=(腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量)/腦組織濕質(zhì)量×100%。

1.2.5腦組織中SOD、MDA測定 采用考馬斯亮藍法測定各組蛋白水平，采用TBA法測定MDA，采用比色法測定SOD，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.2.6腦組織中IκB、NF-κB mRNA的表達水平測定 用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度儀測定提取的總RNA濃度。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 共40個循環(huán)，取PCR產(chǎn)物4 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)和圖像分析系統(tǒng)進行成像及灰度分析，以GAPDH 為參照，分別計算IκB/GAPDH、NF-κB/GAPDH mRNA的比值。

1.2.7腦組織中IκB α、NF-κB p65蛋白表達水平測定 腦組織按1∶5加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4 ℃裂解過夜，4 ℃ 12 000 r/min低溫離心30 min，取上清液，BCA比色法測定蛋白水平，上樣(50 μg/孔)后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白質(zhì)提取物分離，再轉(zhuǎn)至NC膜，牛血清清蛋白(BSA) TBST緩沖系統(tǒng)37 ℃封閉1 h，磷酸化NF-κB p65單克隆抗體孵育2 h，HRP標記兔抗鼠IgG抗體37 ℃孵育1 h，DAB顯色，RAD凝膠電泳圖像分析儀進行采圖，Quanlity One軟件分析光密度值。

2 結(jié) 果

2.1毛蕊異黃酮對大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積、腦組織含水量的影響 模型組有明顯的神經(jīng)行為學(xué)損傷(P<0.05)，毛蕊異黃酮可改善其神經(jīng)行為學(xué)評分，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)；模型組有明顯的腦梗死發(fā)生(P<0.05)，毛蕊異黃酮可降低其腦梗死體積，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)；模型組梗死側(cè)腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，毛蕊異黃酮可降低其腦組織含水量，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積、腦組織含水量比較

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.2毛蕊異黃酮對大鼠腦組織中SOD活性及MDA水平的影響 缺血再灌注24 h后，模型組MDA水平明顯升高(P<0.05)，SOD活性明顯減弱(P<0.05)，毛蕊異黃酮能明顯降低腦組織中MDA的水平并提高SOD活性，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦組織中SOD活性及MDA水平比較

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.3毛蕊異黃酮干預(yù)后大鼠腦組織中IκB、NF-κB mRNA的表達情況 模型組大鼠腦組織中IκB mRNA水平明顯減少(P<0.05)，而NF-κB mRNA水平顯著增加(P<0.05)。毛蕊異黃酮干預(yù)后，IκB mRNA水平明顯升高，而NF-κB mRNA水平則明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腦組織中IκB、NF-κB mRNA的表達情況比較

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.4毛蕊異黃酮干預(yù)后大鼠腦組織中IκB α、NF-κB p65蛋白的表達情況 模型組大鼠腦組織中IκB α蛋白水平明顯減少(P<0.05)，而NF-κB p65蛋白水平顯著增加(P<0.05)。毛蕊異黃酮干預(yù)后，IκB α蛋白水平明顯升高，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)，而NF-κB p65蛋白水平則明顯降低(P<0.05)，見表4、圖1。

表4 各組大鼠腦組織中IκB α、NF-κB p65蛋白的表達情況比較

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與模型組比較

圖1 各組大鼠腦組織中IκB α、NF-κB p65蛋白表達的電泳圖

3 討 論

急性缺血性腦卒中是最常見的卒中類型，腦血流的中斷導(dǎo)致能量的衰竭和神經(jīng)元的死亡，可觸發(fā)免疫應(yīng)答、外周白細胞浸潤腦實質(zhì)和小膠質(zhì)細胞的激活。當(dāng)缺血腦組織獲得再灌注后，產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)自由基，能刺激白細胞活化并釋放多種炎性細胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)]、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、一氧化氮(NO)和更多的ROS，攻擊血管壁，破壞血腦屏障(BBB)，引起繼發(fā)性腦損傷[4-7]。本實驗中，模型組大鼠存在嚴重的神經(jīng)行為學(xué)損傷，腦梗死和腦水腫均較假手術(shù)組嚴重。

毛蕊異黃酮是從中藥黃芪中提取出來的生物黃酮，研究表明其在缺血性腦損傷中具有神經(jīng)保護作用[8-10]，且分子量小，較易通過血腦屏障，將其用于治療腦血管疾病存在天然優(yōu)勢。SOD是腦組織中清除自由基的有效成分，而MDA可以反映氧自由基的生成量并間接反映細胞損傷的程度。本實驗中，毛蕊異黃酮能增強腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中SOD活力，降低MDA 的水平，從而有效地減輕氧自由基的破壞作用，保護腦細胞。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，主要由p65和p50組成，是炎性反應(yīng)復(fù)雜細胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。IκB α是NF-κB的抑制蛋白，靜息狀態(tài)下，能夠以三聚體的形式將NF-κB限制在細胞質(zhì)中。在受到外源性刺激(如腦缺血再灌注損傷)時，IκB α降解，失去抑制作用的NF-κB具有了活性，進入細胞核與DNA結(jié)合，作用于結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控序列，促進大量炎性因子的轉(zhuǎn)錄；若使用抗氧化劑則可以抑制NF-κB信號通路的激活從而減輕腦組織的缺血再灌注損傷[12-17]，而增加IκB α的表達恰恰可以抑制NF-κB p65的表達[16]。本實驗中，模型組IκB α的表達水平明顯降低，NF-κB p65的表達水平明顯升高，表明腦缺血再灌注后由于炎性反應(yīng)被激活，IκB α的抑制作用解除，NF-κB 水平迅速升高。而毛蕊異黃酮的干預(yù)可明顯提高缺血再灌注后腦缺血組織中IκB α的表達，且IκB α表達水平的增加可抑制NF-κB的進一步表達，表明毛蕊異黃酮可以通過恢復(fù)IκB α的活性來抑制由缺血再灌注引起的NF-κB信號通路激活，從而減輕炎性反應(yīng)，保護腦組織。

綜上所述，毛蕊異黃酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與抑制IκB α/NF-κB信號通路的激活有關(guān)，提示毛蕊異黃酮在預(yù)防和減輕腦缺血再灌注損傷方面具有潛在的應(yīng)用前景。