任蕊蕊,劉 松,李江華,堵國成,陳 堅(jiān)

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.3.2.13,Transglutaminase,TGase)可以催化肽鏈中的谷氨酰胺殘基中的γ-羧酰胺基與酰基受體發(fā)生轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，從而使蛋白質(zhì)或多肽之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)[1]?；谔厥獾拇呋磻?yīng)，TGase可使蛋白質(zhì)與賴氨酸交聯(lián)，提升食品的營養(yǎng)價(jià)值[2]；也可改善蛋白類食品功能的特性，如持水性、黏性、乳化穩(wěn)定性，減少儲(chǔ)藏?fù)p失和烹飪損失[3]。因此，TGase在食品加工領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。近年來，TGase在生物技術(shù)研究和醫(yī)藥[4-7]、紡織業(yè)[8]及皮革加工[9]等領(lǐng)域亦展現(xiàn)了較大的應(yīng)用前景。

基于N-端酶原區(qū)對(duì)折疊與分泌的重要影響[10-11]，TGase通常以無活性的酶原(pro-TGase)形式在異源宿主中表達(dá)，再經(jīng)體外蛋白酶切除酶原區(qū)后才得到活性TGase[12-13]。顯然，這種TGase表達(dá)策略不利于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來異源表達(dá)活性TGase的策略主要有兩種：pro-TGase與活化蛋白酶共表達(dá)；酶原與成熟TGase共表達(dá)。Kikuchi等[14]在谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中共表達(dá)pro-TGase與蛋白酶SAM-P45，活性TGase產(chǎn)量達(dá)到142 mg/L。Yurimoto等[15]與李鵬飛等[16]分別在甲醇營養(yǎng)型酵母(Methylotrophicyeasts)和畢赤酵母(Pichiapastoris)中共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了活性TGase的分泌。

盡管研究者已成功獲得TGase在C.glutamicum和P.pastoris等宿主菌中的活性表達(dá)，但總體產(chǎn)酶水平不高。解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)為食品安全菌[17]，發(fā)酵中不需誘導(dǎo)或添加抗生素，能用于食品和藥品相關(guān)酶或蛋白的生產(chǎn)[18]。本研究擬以Y.lipolytica為宿主，通過共表達(dá)茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶激活金屬蛋白酶(TAMEP)[12-13,19]及在TGase N-端插入宿主Kex2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(KR)[20]，實(shí)現(xiàn)活性TGase高效分泌表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

TGase基因來源菌株S.mobaraensis、質(zhì)粒pINA1297/N355Q[21]、pINA1297、Y.lipolyticapo1h/1297[21]和宿主菌Y.lipolyticapo1h由江南大學(xué)生物系統(tǒng)與生物加工工程研究室保藏。pUC57/TAMEP由上海睿迪生物科技有限公司合成。

1.1.2 酶、試劑、引物和DNA序列測(cè)定

限制性核酸內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific公司，膠回收試劑盒和Competent Cell Preparation Kit試劑盒購自Takara(大連)公司，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天公司。引物合成和DNA測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(YPD，g/L)：酵母膏 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20。

篩選培養(yǎng)基(酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基，YNB，g/L)：YNB 6.7，葡萄糖20。

固體培養(yǎng)基則是在液體培養(yǎng)基中加2%的瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 15，酵母膏 20，氯化銨2.64，磷酸二氫鉀 0.32，無水硫酸鎂 0.25，維生素B13.34×10-4，調(diào)pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1S.mobaraensis基因組的提取

用FastPrep破碎儀破碎菌體，破碎強(qiáng)度為6.5，破碎時(shí)間為20 s，每個(gè)樣品破碎10次。然后用植物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因組，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.2.2 質(zhì)粒pINA1297/pro-TGase的構(gòu)建

以pINA1297/N355Q為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增含有酶原區(qū)pro的pINA1297表達(dá)載體。以基因組為模板，P3和P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增TGase基因片段。兩種PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物以摩爾比為1∶2進(jìn)行混合，使用One Step Cloning Kit進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，獲得表達(dá)載體pINA1297/pro-TGase。

1.2.3 插入Kex2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)重組質(zhì)粒pINA1297/pro-KR-TGase的構(gòu)建

以質(zhì)粒pINA1297/pro-TGase為模板，P5和P4引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增含有已加入Kex2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(KR)[20]的茂源鏈霉菌TGase基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后進(jìn)行膠回收，再以回收產(chǎn)物作為引物，以質(zhì)粒pINA1297/pro-TGase為模板進(jìn)行大引物PCR，獲得突變基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后進(jìn)行膠回收，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，獲得重組質(zhì)粒pINA1297/pro-KR-TGase。

1.2.4 活化蛋白酶重組質(zhì)粒pINA1297/TAMEP的構(gòu)建

以質(zhì)粒pINA1297/N355Q為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR，通過PCR擴(kuò)增含有酶原區(qū)的pINA1297表達(dá)載體。以pUC57/TAMEP為模板，P6和P7為引物進(jìn)行PCR，通過PCR擴(kuò)增TAMEP基因。兩種PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物以摩爾比為1∶2進(jìn)行混合，使用One Step Cloning Kit進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，獲得重組質(zhì)粒pINA1297/TAMEP。

1.2.5Y.lipolytica的轉(zhuǎn)化與重組子的篩選

重組質(zhì)粒經(jīng)快切酶NotI酶切后，膠回收得到相應(yīng)的線性化質(zhì)粒。然后用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[22]轉(zhuǎn)化Y.lipolyticapo1h感受態(tài)，質(zhì)粒通過zata整合位點(diǎn)將突變基因整合到Y(jié).lipolyticapo1h(Ura-，ΔAEP，ΔAXP，Suc+)基因組中。整合成功的Y.lipolyticapo1h會(huì)使其從尿嘧啶(ura)缺陷型菌株轉(zhuǎn)化為非缺陷型菌株。通過缺乏ura的YNB培養(yǎng)基28℃，培養(yǎng)3～6 d后，獲得重組菌的陽性轉(zhuǎn)化子。

基于上述轉(zhuǎn)化方法，將pINA1297/pro-TGase轉(zhuǎn)化Y.lipolyticapo1h感受態(tài)獲得重組Y.lipolyticapo1h/pro-TGase；將pINA1297/pro-KR-TGase轉(zhuǎn)化Y.lipolyticapo1h感受態(tài)獲得重組Y.lipolyticapo1h/pro-KR-TGase；將pINA1297/TAMEP轉(zhuǎn)化Y.lipolyticapo1h/pro-TGase感受態(tài)獲得重組Y.lipolyticapo1h/HM+HT。

表1 基因克隆及定點(diǎn)突變引物Table 1 Primers used for gene cloning and site-specific mutagenesis

1.2.6 重組Y.lipolytica的發(fā)酵

選取10～15個(gè)重組菌的陽性轉(zhuǎn)化子，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。將種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)120 h。

1.2.7 TGase的酶活測(cè)定

采用比色法測(cè)定TGase酶活[23]。1個(gè)單位的酶活定義為：在37℃的條件下，每分鐘催化α-N-CBZ-GLN-GLY[24](Sigma)合成1 μmol 的L-谷氨酸-γ-單輕胺酸所用的酶量(U/mL)。

1.2.8 菌體量的測(cè)定

利用紫外可見光分光光度計(jì)(UV2450，Shimadzu，日本)檢測(cè)菌液在600 nm波長處的吸光度值，即OD600。

1.2.9 純化方法

1.2.10 濃度的測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，具體按說明書操作。

1.2.11 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

在底物濃度為0～30 mg/mL范圍內(nèi)設(shè)定濃度梯度，均按1.2.6中所述的方法測(cè)酶活，通過雙倒數(shù)作圖法計(jì)算可得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Y.lipolytica po1h/pro-KR-TGase的構(gòu)建及搖瓶發(fā)酵

將S.mobaraensispro-TGase基因克隆至pINA297得到表達(dá)質(zhì)粒pINA297/pro-TGase(圖1)，轉(zhuǎn)化Y.lipolyticapo1h得到的重組菌Y.lipolyticapo1h/pro-TGase。發(fā)酵分析顯示，Y.lipolyticapo1h/pro-TGase上清液檢測(cè)到TGase活力僅為0.13 U/mL，但在49 ku左右具有明顯的pro-TGase電泳條帶(圖2)，大于理論值43 ku，可能是由于酶表達(dá)時(shí)發(fā)生了糖基化[21]。上述結(jié)果表明，pro-TGase在Y.lipolytica中能高效表達(dá)，但不能高效轉(zhuǎn)化為活性TGase。

A：pINA297/pro-TGase；B：pINA297/pro-KR-TGase；C：pINA297/TAMEP

圖1重組質(zhì)粒示意圖
Figure 1 The plasmids constructed in this study

M：Marker；1：Y.lipolyticapo1h/1297；2：Y.lipolyticapo1h/ pro-TGase

圖2Y.lipolyticapo1h/pro-TGase生產(chǎn)TGase SDS-PAGE分析圖
Figure 2 The SDS-PAGE analysis of TGase produced byY.lipolyticapo1h/pro-TGase

Kex2蛋白酶屬于亞麻酶家族，該家族的酶識(shí)別位點(diǎn)專一，具有將酶原區(qū)加工成有活性酶的功能[25]。Richard等[26]發(fā)現(xiàn)了Kex2蛋白酶也存在于Y.lipolytica中。因此，本研究采用在酶原區(qū)與TGase之間加入Kex2蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)KR[20]的策略，構(gòu)建了質(zhì)粒表達(dá)載體pINA1297/pro-KR-TGase(圖1-B)，確認(rèn)pro-KR-TGase基因序列與公布的序列完全一致。質(zhì)粒經(jīng)NotI線性化后轉(zhuǎn)化Y.lipolyticapo1h感受態(tài)獲得重組Y.lipolyticapo1h/pro-KR-TGase。酶活測(cè)定和SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵0～20 h酶活變化很小，幾乎全部以非活性酶原的形式表達(dá)；20～76 h，TGase的活性基本呈直線上升，最高酶活達(dá)5.26 U/mL；76～120 h后，TGase持續(xù)降解，活性基本呈直線下降(圖3-A、B)。結(jié)果表明，添加Kex2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)明顯促進(jìn)了pro-TGase轉(zhuǎn)化為活性TGase的效率。

圖3重組菌Y.lipolyticapo1h/ pro-KR-TGase發(fā)酵生產(chǎn)TGase的活性(A)及SDS-PAGE分析(B)
Figure 3 The production of TGase byY.lipolyticapo1h/ pro-KR-TGase in shake flask(A),and its SDS-PAGE analysis(B)

2.2 重組菌Y.lipolytica po1h/HM+HT的構(gòu)建和搖瓶發(fā)酵

TAMEP蛋白酶最初從S.mobaraensis中分離出來，可以識(shí)別酶原區(qū)pro序列C-端的FRAP，從而可以切除酶原區(qū)，使pro-TGase轉(zhuǎn)化為活性TGase[19]。由于Y.lipolytica中沒有TAMEP，本研究首次采用共表達(dá)pro-TGase與TAMEP的方法，構(gòu)建了重組Y.lipolytica/HM+HT。重組菌搖瓶發(fā)酵，酶活測(cè)定和SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組菌Y.lipolyticapo1h/HM+HT發(fā)酵 0～20 h酶活變化很小，幾乎全部以非活性酶原的形式表達(dá)；20～110 h，TGase活性基本呈線性緩慢增長，并達(dá)到最大值6.77 U/mL(圖4-A、B)；110～120 h，TGase酶活有下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，添加共表達(dá)TAMEP明顯促進(jìn)了pro-TGase轉(zhuǎn)化為活性TGase的效率。

2.3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析

圖4重組菌Y.lipolyticapo1h/ HM+HT發(fā)酵生產(chǎn)TGase的活性(A)及SDS-PAGE分析(B)
Figure 4 The production of TGase byY.lipolyticapo1h/HM+HT in shake flask(A),and its SDS-PAGE analysis (B)

M：Marker；1：pro-KR-TGase；2：HM+HT

圖5 pro-KR-TGase及HM+HT純化后SDS-PAGE分析
Figure 5 The SDS-PAGE analysis of pro-KR-TGase and HM+HT

糖基化對(duì)酶的正確折疊、分泌、酶活力、酶親和力、底物特異性等具有重要影響[27]。王小燕等[28]通過對(duì)β-葡萄糖醛酸苷酶N115和N418進(jìn)行糖基化修飾提高了酶對(duì)底物的親和力，對(duì)N26和N150進(jìn)行糖基化修飾提高了酶的催化效率。pro-TGase在Y.lipolytica中表達(dá)時(shí)會(huì)發(fā)生糖基化[21]，而S.mobaraensisTGase未發(fā)生糖基化。因此，糖基化可能是導(dǎo)致本研究中TGase的比酶活、酶與底物親和力和催化活力等性質(zhì)優(yōu)于S.mobaraensisTGase的重要原因。

表2 TGase及其突變體酶學(xué)特性Table 2 Enzyme properties of TGase and its mutants

3 討論

為促進(jìn)活性TGase的異源表達(dá)，研究者開展了大量的工作。Kikuchi等[14]在C.glutamicum中共表達(dá)pro-TGase與蛋白酶SAM-P45，活性TGase產(chǎn)量達(dá)到142 mg/L。Yurimoto等[15]在M.yeasts中將pro和TGase作為兩個(gè)獨(dú)立的元件進(jìn)行共表達(dá)，得到的TGase產(chǎn)量為1.83 U/mL；李鵬飛等[16]利用同樣的方法在P.pastoris中實(shí)現(xiàn)了活性TGase的分泌表達(dá)，搖瓶產(chǎn)量最高為0.25 U/mL。本研究通過在pro與TGase直接插入Kex2識(shí)別位點(diǎn)KR和共表達(dá)pro-TGase與活化蛋白酶TAMEP兩種策略，均獲得了活性TGase的分泌，搖瓶發(fā)酵酶活分別可達(dá)5.26 U/mL和6.77 U/mL。與其它報(bào)道相比，本研究獲得的活性TGase具有產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)。此外，與S.mobaraensis成熟TGase相比，通過以上兩種策略得到的成熟TGase的比酶活；酶與底物的親和力Km及酶的催化效率kcat/Km等酶學(xué)性質(zhì)明顯提高。為TGase的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新型高產(chǎn)菌種。

圖6 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶TGase的3-D結(jié)構(gòu)Figure 6 Analysis on 3-D structure of TGase

黃色和紫色分別代表TGase的KR和FRPAP所在TGase 3-D結(jié)構(gòu)的位置(yellow part represents the position of the amino acid sequence Lys-Arg in the TGase 3-D structure,and the purple part represents the location of Phe-Arg-Pro-Ala-Pro)

采用策略1構(gòu)建的重組菌Y.lipolytica/pro-KR-TGase，在發(fā)酵76 h時(shí)酶活達(dá)到最高，但在發(fā)酵76 h之后存在成熟TGase持續(xù)降解的現(xiàn)象。其可能的原因是：S.mobaraensisTGase的第214～215位氨基酸序列為KR，位于一段較短的α-螺旋上，且位于酶蛋白表面(圖6)，可以被Kex2蛋白酶識(shí)別并切割，導(dǎo)致成熟TGase降解。采用策略2構(gòu)建的重組菌Y.lipolytica/HM+HT，在發(fā)酵110 h時(shí)酶活達(dá)到最高，但在發(fā)酵86 h之后也存在成熟TGase持續(xù)降解的現(xiàn)象。其可能的原因是：成熟區(qū)TGase第223～227的氨基酸序列為FRPAP，位于TGase的一段loop環(huán)上，也位于酶蛋白表面(圖6)，且該序列與TAMEP蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)相似，易于被TAMEP識(shí)別并切割，進(jìn)而導(dǎo)致成熟TGase降解。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步鑒定TGase內(nèi)部的Kex2和TAMEP蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，抑制發(fā)酵后期活性TGase的持續(xù)降解。