尹曉剛

（浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310014）

端粒是染色體的保護(hù)性末端，存在于真核細(xì)胞染色體之中，與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了染色體“帽子”結(jié)構(gòu)[1-2]，起著保持染色體完整，控制細(xì)胞有絲分裂的作用[3-4]。端粒的功能異常會導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂的異常，從而使增殖活性降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是抗腫瘤靶點(diǎn)研究的重要內(nèi)容。一系列證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞中的端粒能夠以自身為模板，通過活化的端粒酶進(jìn)行自我復(fù)制、延長，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞永生化的主要因素[5]。

端粒是由端粒DNA與端粒復(fù)合蛋白相結(jié)合的復(fù)合結(jié)構(gòu)，端粒復(fù)合蛋白（shelterin）在端粒長度調(diào)控和保護(hù)端粒的DNA損傷反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。端粒復(fù)合蛋白由六種蛋白組成，分別為端粒重復(fù)序列綁定因子TRF1、TRF2，TRF1相互作用蛋白TIN2，端粒保護(hù)蛋白POT1，TIN2與POT1連接蛋白TPP1，以及受體活化蛋白RAP1[6]。其中對POT1的大量研究中發(fā)現(xiàn)：POT1的表達(dá)與端粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、端粒懸突G-四鏈體的形成息息相關(guān)[7-8]。端粒保護(hù)蛋白POT1是一種高度保守的蛋白，由N端懸突結(jié)合結(jié)構(gòu)域與C端蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，分別結(jié)合端粒末端G-Overhang（端粒3’端懸突結(jié)構(gòu)）與端粒蛋白TPP1，具有維持端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，限制G-Overhang長度等作用。POT1最為重要的作用是能夠誘導(dǎo)G-Overhang反向折回端粒DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，將雙鏈其中一段自身鏈置換出來，互補(bǔ)鏈進(jìn)行配對，形成端粒結(jié)構(gòu)中獨(dú)有的D-Loop（Displacement Loop）與 T-Loop（Telomere Loop），將活性的端粒末端DNA隱藏，從而維持端粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。POT1蛋白的缺失或低表達(dá)對于維持端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、染色體遺傳穩(wěn)定性乃至細(xì)胞產(chǎn)生重大的影響（Figure 1）。

Figure1 The structure of the ternal of telomere

1 POT1蛋白的生物學(xué)意義

1.1 POT1蛋白缺失導(dǎo)致端粒結(jié)構(gòu)破壞

存在于端粒末端的蛋白POT1是形成末端結(jié)構(gòu)D-LOOP與T-LOOP的關(guān)鍵蛋白，POT1蛋白的缺失將導(dǎo)致D-LOOP與T-LOOP之上的鍵合強(qiáng)度降低，使該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，重新轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂蓡捂溄Y(jié)構(gòu)，使得通過形成D-LOOP與T-LOOP結(jié)構(gòu)被隱藏起來的端粒3’端懸突結(jié)構(gòu)重新暴露（端?！懊撁薄保?，導(dǎo)致端粒結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。

細(xì)胞的遺傳增殖是一個(gè)相對保守且穩(wěn)定的過程，其中端粒的存在作用巨大，是細(xì)胞染色體的保護(hù)者。當(dāng)POT1的缺失導(dǎo)致端粒結(jié)構(gòu)發(fā)生“脫帽”時(shí)，由于G-overhang的暴露，使得細(xì)胞中的染色體容易發(fā)生自重復(fù)與四倍體現(xiàn)象，發(fā)生遺傳紊亂。

1.2 POT1蛋白的缺失導(dǎo)致端粒持續(xù)性損傷

端粒是細(xì)胞染色體中的重要結(jié)構(gòu)部分，端粒的存在在很大程度上調(diào)控了細(xì)胞的增殖、凋亡、有絲分裂等必要生命活動，端粒的結(jié)構(gòu)變化將對細(xì)胞的生命活動產(chǎn)生巨大的影響。

在Churikov D等人關(guān)于POT1生物學(xué)功能的研究中[9]，他們通過構(gòu)建雌激素受體（ER）-POT1蛋白的復(fù)合突變株細(xì)胞與野生型細(xì)胞的對照中發(fā)現(xiàn)，在它莫西芬的作用下，兩組細(xì)胞無表現(xiàn)出明顯的區(qū)別。而有趣的是，當(dāng)不受藥物它莫西芬干預(yù)時(shí)，野生型細(xì)胞能夠保持正常生長，而突變株在前24 h細(xì)胞數(shù)量幾乎無明顯變化，而48 h后出現(xiàn)細(xì)胞減少的趨勢，直到無干預(yù)后第三天細(xì)胞全部死亡。說明當(dāng)雌激素受體不受到藥物抑制時(shí)，能夠正常表達(dá)，與POT1蛋白結(jié)合，導(dǎo)致POT1功能異常。在進(jìn)一步探究其作用機(jī)制的研究中，他們嘗試在24 h不干預(yù)它莫西芬后，開始加入藥物，發(fā)現(xiàn)并不能逆轉(zhuǎn)之前的作用損傷，且對ER蛋白與POT1蛋白進(jìn)行熒光染色發(fā)現(xiàn)，兩者在突變株細(xì)胞中表達(dá)均明顯下降。說明當(dāng)POT1下調(diào)表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致的端粒結(jié)構(gòu)發(fā)生不穩(wěn)定的過程是不可逆的。

在Kenkichi M等人對于端粒的研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)端粒末端結(jié)構(gòu)G-Overhang以自由單鏈形態(tài)暴露出來時(shí)，細(xì)胞自身將進(jìn)入DNA損傷狀態(tài)，大量上調(diào)γ-H2AX蛋白表達(dá)，致使細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-11]。由于POT1的缺失，使得端粒的結(jié)構(gòu)被破壞而導(dǎo)致的DNA損傷狀態(tài)被稱為端粒的持續(xù)性損傷，且這個(gè)過程是不可逆的。端粒的持續(xù)性損傷導(dǎo)致細(xì)胞的有絲分裂無法從G2期過渡至M期，使得細(xì)胞周期停滯于G2期，在所有對POT1蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的POT1缺失的突變株細(xì)胞均出現(xiàn)G2-Arrest狀態(tài)[9]。

POT1蛋白對端粒結(jié)構(gòu)的完整性與穩(wěn)定性具有至關(guān)重要的作用，并且由于其不可逆的特性，從POT1蛋白表達(dá)水平研究靶向端粒結(jié)構(gòu)的抗腫瘤小分子化合物是行之有效的途徑[12-14]。

2 以POT1蛋白為靶點(diǎn)的小分子藥物的發(fā)展

2.1 對端粒抑素的研究的發(fā)現(xiàn)推動了靶向POT1蛋白小分子的研究

端粒抑素（Telomestatin）是一種天然存在于人體中的小分子（Figure 2），Dennis Gomez 等人[15]發(fā)現(xiàn)該化合物是一種有效的G-四鏈體的配體，且能靶向結(jié)合于端粒3’端懸突結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的退化。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，這樣的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致了POT1蛋白無法與端粒DNA相結(jié)合，是誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂異常與凋亡的主要因素。

Figure2 The structure of telomestatin.

端粒抑素作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，推動了小分子化合物抗腫瘤的新發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，通過靶向作用腫瘤細(xì)胞中關(guān)鍵性序列與蛋白，誘導(dǎo)其構(gòu)象變化，能夠引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制與凋亡。該類機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，使抗腫瘤的研究不再局限于免疫應(yīng)答與基因手段，大大推動了抗腫瘤研究的進(jìn)展。

2.2 小分子抗腫瘤化合物的發(fā)展

20世紀(jì)末，對于聚酰胺的研究熱潮以及G-四鏈體形成機(jī)制的研究日漸成熟，使得小分子抗腫瘤化合物突破傳統(tǒng)的放療、化療以及免疫治療的壟斷，開拓了一片嶄新的抗腫瘤研究領(lǐng)域。以下重點(diǎn)介紹以小分子化合物誘導(dǎo)G-四鏈體的形成，表現(xiàn)高活性抗腫瘤活性。

在對腫瘤發(fā)病的機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)這是一個(gè)復(fù)雜的病變過程，無明確的病變起因。對于各腫瘤細(xì)胞的普遍研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞之所以能夠?qū)崿F(xiàn)永生化，主要是由于在胞內(nèi)高活性的端粒酶的作用下，以其自身為模板，使端粒得以延伸，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠無限分裂，所以設(shè)計(jì)靶向作用于端粒與端粒酶的小分子化合物，能夠?qū)崿F(xiàn)良好的選擇性。

2.2.1 以端粒末端及POT1蛋白為靶點(diǎn)的G-四鏈體構(gòu)建作用機(jī)制

端粒3’懸突是一段富含鳥嘌呤的序列，在正電荷離子中心的共同作用下，具有共軛大平面結(jié)構(gòu)的小分子化合物能夠嵌插進(jìn)入端粒末端中首尾通過氫鍵相連的鳥嘌呤構(gòu)成的G-四分體之中，通過π-π堆積作用，誘導(dǎo)G-四鏈體的形成（Figure 1）?，F(xiàn)今，已有報(bào)導(dǎo)證實(shí)二萘嵌苯、2，7-二取代氨基芴酮、吖啶、乙啡啶衍生物、二取代三嗪，以及最新發(fā)現(xiàn)的雙角鯊衍生物等具有共軛大平面結(jié)構(gòu)的小分子能夠成功誘導(dǎo)端粒DNA形成G-四鏈體。

端粒末端DNA在小分子化合物的作用下，被誘導(dǎo)形成特殊二級結(jié)構(gòu)-G-四鏈體，使端粒末端T-環(huán)結(jié)構(gòu)與D-環(huán)結(jié)構(gòu)受到破壞，將被隱藏的端粒懸突序列重新暴露，使得端粒末端雙鏈結(jié)構(gòu)破壞致使細(xì)胞出現(xiàn)端粒持續(xù)性損傷。端粒持續(xù)性損傷是導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂周期出現(xiàn)G2-Arrest，誘導(dǎo)細(xì)胞自身凋亡的原因之一，所以以端粒末端為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)能夠誘導(dǎo)其形成G-四鏈體的小分子化合物實(shí)現(xiàn)高活性抑制腫瘤增殖是一個(gè)行之有效的潛在方法。

Figure3 The structure of compound benzothioxanthene derivatives S1-S6

2.2.2 共軛大平面化合物誘導(dǎo)G-四鏈體形成機(jī)制

在本課題組先前已經(jīng)報(bào)道的研究中[16]，已經(jīng)證實(shí)苯并硫雜蒽類衍生物（Figure 3）能夠在細(xì)胞外誘導(dǎo)端粒G-四鏈體的形成，并能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有良好的抗腫瘤活性。為探究該類化合物誘導(dǎo)端粒DNA形成G-四鏈體的機(jī)制，用Discovery Studio軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)分子模擬，以抗腫瘤活性最好的三號化合物（S3）為研究對象，對PDB庫中的端粒DNA晶體進(jìn)行結(jié)合模擬。

從結(jié)果發(fā)現(xiàn)（Figure 4），具有共軛結(jié)構(gòu)的苯并硫雜蒽母環(huán)與同為共軛平面的鳥嘌呤與腺嘌呤存在更好的親和力，易嵌插進(jìn)入腺嘌呤與G-四分體之間的空間，以化合物：DNA=4∶1，2∶1 的比例為主。小分子配體通過與富G之間以π-π堆積作用力為主，氫鍵為輔相結(jié)合，結(jié)合于腺嘌呤與鳥嘌呤之上，誘導(dǎo)端粒DNA向空間結(jié)構(gòu)更緊湊進(jìn)行，最終形成特殊二級結(jié)構(gòu)-G-四鏈體。另一方面，化合物中柔性更好的側(cè)鏈通過空間折疊，嵌入溝槽結(jié)構(gòu)中，通過其上電負(fù)性較強(qiáng)的氮原子與溝槽周邊堿基形成氫鍵，使整個(gè)結(jié)構(gòu)更為牢固、緊湊。

Figure4 The formation of G-quadruplex by computer molecular simulation.

研究表明，在不含正電荷中心K+共同作用時(shí)，具有共軛大平面結(jié)構(gòu)的苯并硫雜蒽類衍生物可以輕易地嵌插進(jìn)入端粒DNA堿基與堿基之間（以腺嘌呤與鳥嘌呤、胸腺嘧啶與鳥嘌呤之間的空間為主），G-四鏈體溝槽之間，通過化合物：核酸=4∶1作用比例，強(qiáng)有力地誘導(dǎo)并穩(wěn)定G-四鏈體的形成（Figure 4A）。對含有正電荷中心與化合物共同作用，與同一個(gè)DNA晶體進(jìn)行結(jié)合模擬發(fā)現(xiàn)，結(jié)果整個(gè)DNA構(gòu)型發(fā)生了有趣的變化，所有相鄰堿基之間的空間縮小，整個(gè)DNA表現(xiàn)出更緊湊的構(gòu)型。此時(shí)在正電荷中心K+作用下，化合物與DNA更多以2∶1比例相結(jié)合，苯并硫雜蒽化合物π電子受到中心K+牽引，嵌入更加完全，使整個(gè)G-四鏈體結(jié)構(gòu)展現(xiàn)更穩(wěn)定構(gòu)象（Figure 4B）。

3 結(jié)語

對POT1蛋白的研究已較為完善，但卻未能有以其為靶點(diǎn)的高效抗腫瘤藥物的上市。POT1蛋白的存在與端粒末端的穩(wěn)定息息相關(guān)，對兩者的相關(guān)研究中，以端粒酶抑制劑為主的抗腫瘤藥物占大多數(shù)。由于在之前的研究中，對于以POT1蛋白的治療未能夠跳脫出基因手段，導(dǎo)致了其局限性及進(jìn)入臨床的困難。新技術(shù)的出現(xiàn)固然是抗腫瘤研究中的重要部分，但新思路的形成也同樣重要。研究已久的靶點(diǎn)形成的新作用機(jī)制，希望能夠一定意義上推動抗腫瘤研究的發(fā)展。