班 珺 謝巖黎

(河南工業(yè)大學糧油食品學院1，鄭州 450052)(河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室2，鄭州 450052)(廣西崇左市食品藥品監(jiān)督管理局;崇左市食品藥品檢驗所3，崇左 532200)

黃曲霉毒素是由黃曲霉、特曲霉以及寄生曲霉等產(chǎn)生的一類含有二氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物[1-2]。在已分離出的20余種黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)致癌性最強，被認為是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要因素之一[3]。為保障食品安全及人類健康，GB 2761—2017[4]對我國食品中AFB1的限量規(guī)定為：花生、玉米及其制品≤ 20 μg/kg，稻谷、糙米、大米、植物油脂≤ 10 μg/kg，谷物類、豆類、堅果類、釀造調(diào)味品≤ 5 μg/kg。長期以來，科研工作者為AFB1的檢測探索了許多方法，常見的傳統(tǒng)方法有薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、液質(zhì)聯(lián)用法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]等，新興的檢測方法有電化學免疫傳感器[9]、化學發(fā)光免疫法[10]、太赫茲光譜法[11]、核酸適體法[12]等，這些方法的產(chǎn)生極大豐富了AFB1的檢測。當前針對AFB1的檢測方法眾多，每種方法各有其優(yōu)缺點，儀器檢測法靈敏度高、結(jié)果較為可靠，但所需儀器昂貴、前處理復雜繁瑣，不便于大批量檢測；免疫學法檢測速度快、操作簡單，但所用的抗體制備成本高，保存條件苛刻，批間質(zhì)量不一，易出現(xiàn)假陽性。因此，開發(fā)高效、便捷、靈敏的檢測方法成為當務(wù)之急。

核酸適體(Nucleic acid aptamer)是采用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)從體外人工合成的單鏈核酸文庫中篩選出能與靶物質(zhì)高特異性、高親和力結(jié)合的寡核苷酸片段[13-14]。核酸適體因其靶物質(zhì)范圍廣、親和力高、特異性強等特點，在毒素[15-18]、蛋白[19-22]、激素[23-25]、農(nóng)藥[26-28]、金屬離子[29-31]、細胞[32-35]等的檢測領(lǐng)域成為重要工具。目前，基于核酸適體的AFB1檢測方法，如納米金法[36]、化學發(fā)光法[37]、電化學法[38]等相繼報道。

本研究根據(jù)核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號檢測靶分子的原理[39-40]，將標記有羧基熒光素(Carboxy Fluorescein,FAM)的AFB1核酸適體與標記猝滅基團(Black Hole Quencher 1,BHQ1)的AFB1核酸適體互補鏈配對雜交，通過AFB1競爭結(jié)合核酸適體的位點使熒光恢復，建立了基于核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換熒光法檢測AFB1的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Cary Eclopse熒光分光光度計：美國VARIAN公司，實驗測定參數(shù)：激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長505～600 nm，激發(fā)狹縫10 nm，發(fā)射狹縫10 nm。

黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、雪腐鐮刀菌烯醇(DON)標準品：Sigma Aldrich公司；玉米赤霉烯酮(ZEN)標準品：北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、HCl、三羥甲基氨基甲烷等：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。實驗用水均為純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司。

實驗所用AFB1核酸適體及其互補鏈均由上海生工生物工程有限公司合成并經(jīng)HPLC純化，序列如下：核酸適體1：5′-FAM-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′；猝滅鏈1：5′ -ACACGTGCCCAAC-BHQ1-3′； 核酸適體2：5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGG CCCACA-FAM-3′； 猝滅鏈2：5′-BHQ1-TGTGGGCCTAGCG-3′。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光基團標記位置及工作液的選擇

以PBS為工作液，比較FAM熒光基團標記核酸適體不同端位對熒光恢復情況的影響，選擇熒光恢復率最佳的核酸適體鏈，以Tris-HCl為工作液測定檢測系統(tǒng)的熒光恢復率，比較不同工作液對熒光恢復情況的影響。通過(F-F0)/F0求熒光增長率，其中F0為猝滅狀態(tài)時的熒光強度，F(xiàn)為加入毒素后的熒光強度。

1.2.2 猝滅鏈濃度的選擇

用工作液將BHQ1標記的猝滅鏈配制成100、120、140、160、180、200、220、240 nmol/L，分別與200 nmol/L FAM標記核酸適體反應(yīng)30 min并測定其熒光強度，觀察不同濃度互補鏈對核酸適體熒光基團的猝滅程度。

1.2.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

將200 nmol/L核酸適體與猝滅鏈反應(yīng)30 min后，向反應(yīng)體系加入50 ng/mL AFB1并記錄其加入反應(yīng)體系10、20、40、60、80、120 min后的熒光強度，選擇最適反應(yīng)時間。

1.2.4 AFB1的定量檢測

用PBS緩沖液將核酸適體2、猝滅鏈2配制成200 nmol/L，將AFB1母液稀釋成0、0.1、1、10、50、100、200、300 ng/mL，在優(yōu)化好的檢測體系中進行標準曲線的建立。400 μL 200 nmol/L核酸適體2與400 μL 200 nmol/L猝滅鏈2反應(yīng)30 min后，將800 μL一系列不同濃度的AFB1標準液加入反應(yīng)體系，充分反應(yīng)1h后測定其熒光強度，以AFB1濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標建立熒光法檢測AFB1的標準曲線。

1.2.5 方法特異性考察

將赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雪腐鐮刀菌烯醇(DON)配制成100 ng/mL。以PBS作為工作液，將200 nmol/L核酸適體2與200 nmol/L猝滅鏈2反應(yīng)30 min，分別向反應(yīng)體系中加入100ng/mL OTA、ZEN、DON，平衡孵育1h后采用熒光分光光度計測定熒光強度。通過(F-F0)/F0對該檢測方法的特異性進行分析，其中F0為猝滅狀態(tài)時的熒光強度，F(xiàn)為加入毒素后的熒光強度。

1.2.6 樣品測定

將花生、玉米粉碎，過20目篩，稱取5 g樣品，以20 mL乙腈-水(85∶15)為提取液高速均質(zhì)5 min，4 000 r/min高速離心5 min后取4 mL上清液，氮吹儀吹干提取液，加入1mL PBS工作液復溶，采用優(yōu)化好的檢測方法測定樣品的初始濃度C0?；厥諏嶒炛?，向樣品加入不同量的AFB1，使樣品含AFB1分別為5、20、60 μg/kg，采用優(yōu)化好的檢測方法檢測加標后的檢測濃度C1，以(C1-C0)/加標濃度計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

檢測原理如圖1所示，AFB1競爭結(jié)合核酸適體的位點，導致猝滅基團標記的核酸互補鏈脫落，核酸適體構(gòu)象發(fā)生改變，檢測體系熒光恢復，根據(jù)熒光強度變化對AFB1進行定量檢測。檢測系統(tǒng)初始狀態(tài)為標記熒光基團(FAM)的AFB1核酸適體與標記猝滅基團(BHQ1)的互補鏈通過堿基互補配對結(jié)合，由于二者之間距離很近，導致FAM被BHQ1猝滅，檢測體系處于弱熒光的猝滅狀態(tài)。當待測物中含AFB1，AFB1將與核酸適體發(fā)生特異性結(jié)合，核酸適體結(jié)構(gòu)的改變迫使互補鏈從核酸適體上脫落，使熒光基團與猝滅基團的距離變遠，檢測體系中熒光強度得以恢復。當待測物中無AFB1存在時，核酸適體結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，熒光強度維持初始的猝滅狀態(tài)。

圖1 AFB1檢測原理示意圖

2.2 熒光基團標記位置及工作液的選擇

實驗對FAM熒光基團標記核酸適體端位及反應(yīng)體系的工作液進行了研究。核酸適體1為5′端標記FAM的寡核苷酸序列，核酸適體2為3′端標記FAM的寡核苷酸序列。圖2為等濃度核酸適體1、核酸適體2于不同工作液中的熒光強度比較，圖3為核酸適體1、核酸適體2在猝滅狀態(tài)加入AFB1后的熒光增長率。由圖2、圖3比較可知，工作液為PBS時，等濃度的核酸適體2熒光強度高于核酸適體1，造成該結(jié)果的原因可能為核酸適體5′ 末端的鳥嘌呤對FAM熒光基團產(chǎn)生了一定的猝滅作用，熒光強度較標記在3′端序列的熒光強度弱。當加入猝滅鏈使FAM猝滅80% 后加入50 ng/mL AFB1，核酸適體2的熒光增長率(60.08%)明顯高于核酸適體1的熒光增長率(17.82%)，該結(jié)果表明FAM標記在3' 端的核酸適體較標記在5' 端的核酸適體更有利于與AFB1結(jié)合，這與核酸適體自身形成的空間位阻及AFB1有效識別區(qū)域有關(guān)。

以核酸適體2進一步研究工作液對熒光強度的影響，由圖2可知，等濃度核酸適體下，以PBS為工作液的熒光強度略高于以Tris-HCl為工作液的熒光強度，當加入猝滅鏈使FAM均猝滅80% 后加入50 ng/mL AFB1，以PBS為工作液的核酸適體熒光增長率(60.08%)高于以Tris-HCl為工作液的熒光增長率(30.58%)(圖3)。上述結(jié)果表明以PBS為工作液更有利于FAM的熒光發(fā)生，也更有利于AFB1與核酸適體的結(jié)合。綜合考慮，選擇核酸適體2并以PBS為工作液進行后續(xù)實驗探究。

圖2 200 nmol/L核酸適體1與核酸適體2于不同工作液中的熒光比較

圖3 猝滅狀態(tài)下加入50 ng/mL AFB1后的熒光增長率

2.3 猝滅鏈濃度的選擇

向200 nmol/L核酸適體2中加入一系列濃度(0、100、120、140、160、180、200、220、240 nmol/L)猝滅鏈2，充分反應(yīng)30 min后測定熒光強度如圖4所示。猝滅鏈在100 nmol/L至200 nmol/L時，隨著濃度的增加，反應(yīng)體系中熒光強度迅速降低，當猝滅鏈濃度為200 nmol/L時，反應(yīng)體系中的熒光強度已被猝滅80%，繼續(xù)加大猝滅鏈濃度，反應(yīng)體系的熒光強度仍呈減弱狀態(tài)，但變化趨勢向緩。為防止猝滅鏈濃度過大對AFB1競爭核酸適體的結(jié)合位點造成影響，實驗最終選擇200 nmol/L作為猝滅鏈最適濃度進行后續(xù)研究。

圖4 猝滅鏈濃度的優(yōu)化

2.4 反應(yīng)時間的優(yōu)化

200 nmol/L核酸適體2與200 nmol/L猝滅鏈2反應(yīng)30 min后，向反應(yīng)體系加入50 ng/mL AFB1，圖5為AFB1加入反應(yīng)體系后的10、20、40、60、80、120 min后的熒光強度。由圖看出，在AFB1加入后的10至60 min，熒光強度迅速增強，說明隨著反應(yīng)時間的增加，AFB1與核酸適體結(jié)合越充分，F(xiàn)AM與BHQ1之間的距離變得越遠，熒光強度越強。AFB1加入60 min后，熒光強度較60 min時略微增強但程度趨緩，從檢測效率的角度考慮，最終選擇60 min為AFB1與核酸適體最適反應(yīng)時間。

圖5 反應(yīng)時間的優(yōu)化

2.5 AFB1的定量檢測

在優(yōu)化好的檢測體系中對一系列濃度AFB1進行檢測，圖6為0、0.1、1、10、50、100、200、300 ng/mL AFB1加入反應(yīng)體系后的熒光光譜圖。由圖7可知，隨著AFB1濃度的增加，F(xiàn)AM與BHQ1距離變遠，反應(yīng)體系由猝滅狀態(tài)開始恢復熒光，AFB1濃度越大，熒光強度越強。結(jié)果表明，AFB1在1～300 ng/mL濃度范圍內(nèi)與反應(yīng)體系熒光強度具有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.759 9X+148.928 3(R2=0.996 0)，以空白樣品均值的3倍標準偏差除以標準曲線斜率計算得到該檢測方法的理論檢出限為0.8 ng/mL。

圖6 不同濃度AFB1加入反應(yīng)體系后的熒光光譜圖

圖7 不同濃度的AFB1檢測

2.6 特異性

為考察本方法的特異性，選擇糧食中常見的幾種毒素：赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，將它們配制成100 ng/mL并運用本研究建立的AFB1檢測方法對其進行檢測。實驗結(jié)果如圖8所示，在反應(yīng)系統(tǒng)中分別加入100ng/mL DON、OTA、ZEN后，熒光增長率分別為0.20%、3.29%、12.68%，與反應(yīng)猝滅狀態(tài)時的熒光強度接近，而AFB1在100 ng/mL時的熒光增長率為90.44%，遠遠高于其他毒素，說明實驗所選用的核酸適體對AFB1具有極強的識別選擇性，本研究建立的AFB1檢測方法特異性較強。

圖8 方法選擇性考察

2.7 回收率

以花生、玉米為樣本向其中添加AFB1標準品，使?jié)舛确謩e為5、20、60 μg/kg，采用本研究建立的方法進行檢測，實驗結(jié)果如表1所示，花生中的AFB1回收率為95.4%～108.0%之間，玉米中的AFB1回收率為77.7%～84.7%之間，效果良好。

表1 實際樣品的測定

3 結(jié)論

利用核酸適體能對靶物質(zhì)特異性結(jié)合迫使互補鏈解離的作用，建立了核酸適體識別AFB1熒光恢復檢測法。該法操作簡便、靈敏度高、選擇性好，可以滿足實際樣品中AFB1的檢測需求。該檢測方法的原理同樣適用于對其他基于核酸適體檢測小分子靶物質(zhì)的方法設(shè)計。