單光明 聶黎虹 郭鳳英 朱亞洲 秦凱悅 杜丹丹 田國林 趙瑞寧

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1總醫(yī)院泌尿外科，寧夏 銀川 750004；2研究生學(xué)院；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4 2015級本科生)

睪丸是男性生殖器官的一部分，具有分泌雄性激素、產(chǎn)生精子、維持正常男性生育功能和性功能的作用〔1〕。由于雄激素特殊的生理功能，部分人群選擇外源性給予雄激素以達(dá)到提高性欲、提高運(yùn)動成績、男性藥物避孕等目的〔2,3〕。但外源性雄激素的不合理應(yīng)用，可能致使睪丸萎縮，進(jìn)而影響其正常生理功能〔2〕。目前外源性雄激素致睪丸萎縮的機(jī)制尚未闡明。自噬是真核生物細(xì)胞調(diào)節(jié)自身生長、死亡、能量代謝的重要機(jī)制，其在增生、衰老、退行性變、炎癥變等病理生理過程中發(fā)揮重要的作用〔4,5〕。研究表明，雄激素可以調(diào)控細(xì)胞自噬的水平〔6〕；而精索靜脈曲張可致睪丸生精小管上皮細(xì)胞自噬水平上調(diào)〔4〕。關(guān)于外源性雄激素是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平參與睪丸萎縮病理過程的發(fā)生未見報道。本研究通過外源性給予雄激素丙酸睪丸酮(TP)及自噬抑制劑，采用分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)等技術(shù)，探討外源性雄激素是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平變化參與睪丸萎縮病理過程的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑 雄性SD大鼠，體重250～270 g，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。TP(北京Solarbio公司，中國)；氯喹(CQ，Sigma公司，美國)；甘草甜素(Gly，東京化成工業(yè)株式會社，日本)；全蛋白提取試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(江蘇凱基生物，中國)；兔抗Beclin-1；兔抗p62(Proteintech公司，美國)；兔抗LC3B(Sigma公司，美國)；兔抗HMGB1(Abcam公司，英國)；鼠抗β-actin和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗和HE染料(北京中杉金橋公司，中國)。

1.2動物分組與模型建立 48只SD大鼠隨機(jī)分為6組：對照(control)組、TP組、TP+CQ組、TP+Gly組、CQ組、Gly組，每組8只。TP組皮下注射TP(3 mg·kg-1·d-1)；TP+CQ組皮下注射TP(3 mg·kg-1·d-1)加腹腔注射CQ(50 mg·kg-1·d-1)；TP+Gly組皮下注射TP(3 mg·kg-1·d-1)加腹腔注射Gly(10 mg·kg-1·d-1)；CQ組僅腹腔注射CQ(50 mg·kg-1·d-1)；Gly組僅腹腔注射Gly(10 mg·kg-1·d-1)；control組腹腔注射生理鹽水(2.5 ml·kg-1·d-1)。每組處理時間均為21 d。

1.3標(biāo)本收集與睪丸指數(shù)計算 各組稱重后麻醉(10%水合氯醛，0.3 ml/100 g)，摘取睪丸組織，迅速測量睪丸濕重，計算睪丸指數(shù)。大鼠睪丸指數(shù)=睪丸濕重(g)/體重(kg)。測量后兩側(cè)睪丸分別進(jìn)行病理學(xué)和Western印跡法蛋白檢測。

1.4HE染色觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)改變 取一側(cè)睪丸用冷生理鹽水沖洗后，置于4%多聚甲醛中固定，24 h后將其修剪后置于包埋盒中脫水過夜；次日進(jìn)行浸蠟、包埋，冷凝后進(jìn)行組織切片、烤片；將切片進(jìn)行脫蠟水化并染色，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；在光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸組織病理學(xué)變化。

1.5Western印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取另一側(cè)大鼠睪丸，全蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后定量。將每組蛋白60 μg加入不同泳道中行電泳70 min后，采用半干轉(zhuǎn)方式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%牛奶室溫封閉1.5 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，加一抗4℃孵育過夜后，PBST洗膜3次，二抗室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，于凝膠成像儀拍照。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行析因設(shè)計的方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組體重、睪丸濕重及睪丸指數(shù)的比較 與control組比較，TP組睪丸濕重、指數(shù)均顯著下降(P<0.01)；與TP組比較，TP+CQ和TP+Gly組睪丸指數(shù)均顯著上升(P<0.05)；TP+CQ和TP+Gly組與control組比較，睪丸濕重顯著減輕(P<0.05)，但睪丸指數(shù)無明顯變化(P>0.05)；CQ和Gly組與control組比較，睪丸濕重和指數(shù)均無明顯差異(P>0.05)；見表1 。

2.2各組睪丸組織形態(tài)學(xué)分析 control組睪丸生精小管形態(tài)規(guī)則，各級生精細(xì)胞層次分明、有序排列；管腔內(nèi)可見大量成熟的精子，旋渦狀表現(xiàn)。TP組生精小管形態(tài)不規(guī)則；生精細(xì)胞層數(shù)明顯減少、排列紊亂；管腔內(nèi)成熟的精子稀少，部分管腔內(nèi)出現(xiàn)脫落的生精細(xì)胞團(tuán)塊。TP+CQ組和TP+Gly組生精小管管腔稍不規(guī)則，與TP組比較生精細(xì)胞層數(shù)和排列狀況均明顯改善；管腔內(nèi)可見成熟的精子，未見脫落的生精細(xì)胞團(tuán)塊。CQ組和Gly組睪丸生精小管形態(tài)、結(jié)構(gòu)與control組類似，見圖1。

表1 各組體重、睪丸濕重和睪丸指數(shù)的比較

與 control組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與TP組比較:3)P<0.05,4)P<0.01

圖1 各組睪丸組織染色

2.3各組睪丸組織相關(guān)蛋白的表達(dá) 與control組(0.66±0.06，0.69±0.10，0.77±0.07)比較，TP組睪丸組織Beclin-1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表達(dá)水平(0.91±0.09，1.05±0.08，1.07±0.15)均顯著上調(diào)(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(0.50±0.04，0.46±0.10，P>0.05)。與TP組比較，TP+CQ組睪丸組織Beclin-1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表達(dá)水平(0.65±0.06，0.71±0.04，0.74±0.08)均顯著下調(diào)(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)仍無統(tǒng)計學(xué)差異(0.53±0.06，P>0.05)；TP+Gly組上述各蛋白表達(dá)(0.58±0.05，0.74±0.04，0.82±0.06，0.50±0.09)與TP+CQ組結(jié)果類似，兩組各蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。CQ組上述各蛋白表達(dá)(0.58±0.07，0.61±0.04，0.84±0.08，0.48±0.04)和Gly組(0.65±0.13，0.61±0.05，0.80±0.11，0.46±0.07)與control組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖2。

1～6：control組、TP組、TP+CQ組、TP+Gly組、CQ組、Gly組圖2 各組睪丸組織相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

雄激素主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成、分泌，可發(fā)揮促男性性器官成熟、第二性征出現(xiàn)、維持正常性欲和生殖等作用。在睪丸內(nèi)，雄激素通過受體介導(dǎo)影響睪丸支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)各級生精細(xì)胞的分化及精子的成熟。體內(nèi)雄激素水平異常變化會影響睪丸結(jié)構(gòu)與功能。外源性雄激素可通過影響生精細(xì)胞的分化，致使成熟精子數(shù)量明顯減少以達(dá)到男性避孕的目的〔3〕。研究表明，雄激素可以調(diào)控細(xì)胞自噬的水平；其可通過增加細(xì)胞自噬和自噬流發(fā)揮促前列腺癌細(xì)胞代謝和增殖的作用〔6〕；雄激素受體可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控自噬核心基因和溶酶體基因促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展〔7〕。且在精索靜脈曲張等疾病發(fā)生過程中，睪丸細(xì)胞自噬水平也發(fā)生改變〔4〕。這些現(xiàn)象提示雄激素可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬參與睪丸萎縮的病理過程。

本研究表明外源性雄激素可致睪丸萎縮。LC3是自噬啟動的特異性標(biāo)記蛋白，LC3B-Ⅱ的蛋白水平是反映自噬最基本的指標(biāo)。Beclin-1是首個被鑒定介導(dǎo)哺乳動物自噬的蛋白，在自噬體形成過程中是不可或缺的條件〔8〕。本文結(jié)果提示雄激素致睪丸萎縮過程中可能上調(diào)了細(xì)胞自噬水平。HMGB1

是重要的自噬調(diào)控因子〔9,10〕，細(xì)胞內(nèi)不同空間定位的HMGB1均可通過相應(yīng)機(jī)制調(diào)控自噬發(fā)生。那么表達(dá)增多的HMGB1是否參與了雄激素致睪丸萎縮過程中自噬水平上調(diào)呢？本文提示細(xì)胞自噬水平的上調(diào)參與了雄激素致睪丸萎縮的病理過程。睪丸萎縮過程中表達(dá)增多的HMGB1參與了睪丸細(xì)胞自噬水平的上調(diào)。

綜上，外源性雄激素可能通過上調(diào)自噬水平引發(fā)大鼠睪丸萎縮病理過程的發(fā)生，HMGB1可能在此過程中調(diào)節(jié)自噬水平改變。但在睪丸萎縮病理過程中，雄激素通過何種方式調(diào)控自噬，HMGB1在此過程中如何發(fā)揮促自噬的作用及雄激素和HMGB1是否具有協(xié)同調(diào)控自噬的作用均需進(jìn)一步探討。