王鵬洋，付澤元，孫立坤，喬碩

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序性死亡（Programmedcelldeath，PCD），是細(xì)胞生物體中一些細(xì)胞采用的由自身基因調(diào)控通過信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞主動(dòng)死亡的方式[1]。它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等作用，不造成炎癥和自體的損傷，是細(xì)胞為了更好地適應(yīng)自下而上環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的死亡過程[2]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞重要的生命活動(dòng)特征，在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要作用[3-4]。對(duì)細(xì)胞凋亡的研究最早始于動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞凋亡研究起步較晚。植物細(xì)胞凋亡存在于植物體正常生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，是植物體抵御病原體和抵抗逆境的重要手段[4-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為新鮮的洋蔥，取其鱗片葉內(nèi)表皮，現(xiàn)用現(xiàn)取，保持新鮮濕潤(rùn)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)處理材料的NaCl濃度梯度和時(shí)間梯度：濃度設(shè)為5個(gè)梯度：0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L；時(shí)間設(shè)為 3 個(gè)梯度：0.5h、1h、2h。

1.2.2材料處理

將配置好的不同濃度的NaCl溶液分裝到2ml離心管中，每小管中裝1ml，每濃度梯度5管備用；連洋蔥肉帶內(nèi)表皮切洋蔥小塊，面積約0.5cm×0.5cm，將洋蔥小塊泡入離心管溶液中。后開始計(jì)時(shí)，分別在0.5h、1h、2h時(shí)從每個(gè)濃度梯度的離心管中取出一塊洋蔥塊，撕下洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮置于載玻片上。設(shè)置對(duì)照組，即直接固定染色制片的一組。

1.2.3裝片制作與觀察

卡諾固定液固定15分鐘，95%酒精處理5分鐘，70%酒精處理5分鐘，清水將酒精洗去，3%甲基綠∶派洛寧=3∶1，染色30分鐘，用清水洗去染料浮色，用分析純丙酮漂洗5秒，再用清水洗去丙酮，蓋上蓋玻片后用吸水紙洗去多余水分，后用光學(xué)顯微鏡鏡檢觀察。觀察細(xì)胞凋亡情況與形態(tài)特征變化，對(duì)觀察結(jié)果進(jìn)行拍照，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞凋亡率=細(xì)胞凋亡數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù)×100%[7]。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

用MicrosoftExcel和Origin軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

空白對(duì)照組在NaCl處理Oh的細(xì)胞形態(tài)結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞整體形態(tài)飽滿且輪廓分明；細(xì)胞膜完整，緊貼細(xì)胞壁；細(xì)胞核呈完整的圓球形狀，染色均勻，視野中沒有已經(jīng)凋亡的細(xì)胞。

2.2 不同濃度NaCl處理0.5h后，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

從圖2中可見，在不同濃度的NaCl處理0.5h后，洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞發(fā)生不同程度的質(zhì)壁分離，細(xì)胞壁依然完整，可以看到清晰的細(xì)胞壁輪廓；隨著濃度的升高，質(zhì)壁分離越明顯，細(xì)胞膜皺縮程度越高，直到濃度較高的實(shí)驗(yàn)組有細(xì)胞膜破裂的現(xiàn)象出現(xiàn)，有的細(xì)胞正處于凋亡的過程中，可見凋亡小體；細(xì)胞核在濃度高的實(shí)驗(yàn)組中不完整，染色質(zhì)邊緣化貼近細(xì)胞膜。

圖1對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖

2.3 不同濃度NaCl處理1h后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

從圖3中可見，在不同濃度的NaCl處理1h后，細(xì)胞質(zhì)壁分離程度較0.5h實(shí)驗(yàn)組的相比其程度不再加大；NaCl濃度為0.1mol/L和0.2mol/L的實(shí)驗(yàn)組與處理0.5h相比總體變化不大，細(xì)胞膜沒有破碎痕跡，沒有出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞核清晰球狀沒有大的變化；0.5mol/L實(shí)驗(yàn)組處理1h的比0.5h的細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞數(shù)量增多，存在凋亡小體的細(xì)胞數(shù)目也增多；1mol/L和2mol/L實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞膜破碎程度加大，更多的細(xì)胞核邊緣界限模糊不清晰且不完整。

2.4 不同濃度NaCl處理2h后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

從圖4可見，處理2h后，總體染色加深，細(xì)胞質(zhì)呈明顯紅色，細(xì)胞核綠色加深；0.1mol/L和0.2mol/L的實(shí)驗(yàn)組依然沒有出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，但是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核染色加深；0.5mol/L實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象較先前實(shí)驗(yàn)較明顯，可見一些細(xì)胞正處于凋亡中，存在凋亡小體；1mol/L和2mol/L的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞進(jìn)一步凋亡，細(xì)胞背景較之前不干凈，有些細(xì)胞已經(jīng)凋亡完成或接近凋亡完成的狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜極度殘缺。

2.5 不同濃度與處理不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)分析

從圖5中可見，隨著NaCl濃度的升高，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)，且趨勢(shì)大致相同，濃度在0.1mol/L和0.2mol/L實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞凋亡率較低，該濃度還不至于引起細(xì)胞凋亡，濃度在0.2mol/L和1mol/L之間變化時(shí)，其凋亡率增加最快，隨后凋亡率增加趨勢(shì)再趨于平緩；縱向觀察，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，凋亡率有明顯的增加，在濃度為2mol/L處理時(shí)間2h的實(shí)驗(yàn)組中，凋亡率已經(jīng)趨近于100%。

3 討論

圖2不同濃度NaCl處理0.5h后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖

圖3不同濃度NaCl處理1h后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖

圖4不同濃度NaCl處理2h后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖

圖5細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)圖

顯微觀察結(jié)果表明，NaCl可以誘導(dǎo)洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化是相似的，過程是多階段的。主要包括：細(xì)胞核濃縮、邊緣化、質(zhì)膜卷曲、質(zhì)壁分離、細(xì)胞核消失，直至細(xì)胞膜反折，最終形成凋亡小體[8]。得到結(jié)論：NaCl濃度越高其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力越強(qiáng)；誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng)，其細(xì)胞凋亡率越高。在動(dòng)物細(xì)胞中很容易觀察到凋亡小體，而植物細(xì)胞中很難觀察到[9]。有研究表明，細(xì)胞凋亡與caspase（胱冬酶）有關(guān)，其為信號(hào)誘導(dǎo)，激活caspase，后產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到，濃度在0.2mol/L和1mol/L之間的凋亡率激增，預(yù)測(cè)在這個(gè)濃度范圍內(nèi)可以觀察到更多正處于凋亡過程的細(xì)胞，下一步實(shí)驗(yàn)要在濃度0.2mol/L和1mol/L之間分設(shè)梯度，從而更清楚地觀察洋蔥細(xì)胞正處于凋亡過程中的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。