石菲菲，王 麗，史依沫，3，張衛(wèi)東，崔曉瑞，劉小飛，潘 妍，宋洪波，李淑榮，*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；4.中國原子能科學(xué)研究院，北京 102413)

食品在加工和貯藏過程中易被致病菌污染，由食源性致病菌引起的食品安全事件在世界范圍內(nèi)頻繁發(fā)生，成為近年來全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題[1]。李斯特菌作為一種常見且致病性較強(qiáng)的食源性致病菌受到了越來越多的關(guān)注[2]。目前國際上公認(rèn)的李斯特菌屬共有7個(gè)菌種，其中單核細(xì)胞增生性李斯特菌、綿羊李斯特菌和英諾克李斯特菌對人類有一定的致病性[3]。李斯特菌生存環(huán)境可塑性大，可在2～42 ℃下生存，并可在酸性或堿性條件下存活并生長繁殖。該菌在環(huán)境中無處不在，如土壤、污水、飼料、動(dòng)物、人體及各種生食和即食食品中，包括生肉及熟肉制品、速凍米面食品、奶酪、蔬菜、沙拉和海產(chǎn)品等[4-5]。近年來，由李斯特菌引起的食品安全事件頻繁發(fā)生，因此，如何快速有效地控制食品中李斯特菌的污染，防止其危害人體健康成為當(dāng)前亟待解決的問題。

食品工業(yè)中，傳統(tǒng)的殺菌方式是加熱處理，它具有殺菌譜廣、殺菌作用快等優(yōu)點(diǎn)，但對于熱敏性食品，可引起感官品質(zhì)下降，以及營養(yǎng)和風(fēng)味成分損失[6-7]。隨著生活水平的提高，人們對食品的感官品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、新鮮程度有更高的要求，熱處理技術(shù)無法滿足這樣的要求，所以非熱殺菌技術(shù)逐漸受到人們的重視。輻照殺菌是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新型食品非熱殺菌技術(shù)，因其能耗低、無污染、滅菌徹底、對營養(yǎng)成分影響小、能有效控制食源性疾病等優(yōu)點(diǎn)得到了各國學(xué)者的關(guān)注[8-10]，并在食品安全領(lǐng)域得到了很好的應(yīng)用[11-12]，是目前商業(yè)化最好的非熱加工技術(shù)。關(guān)于輻照殺菌的研究目前為止主要集中在輻照工藝方面，有關(guān)輻照殺菌機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道。

本文以英諾克李斯特菌1.2990為研究對象，以電子束為輻照源，研究不同輻照劑量對英諾克李斯特菌生理特性的影響，對細(xì)胞膜通透性、胞內(nèi)離子泄漏量、Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活性、膜電位以及菌懸液pH值的變化進(jìn)行研究，以揭示電子束輻照導(dǎo)致細(xì)菌死亡的原因，旨為電子束輻照在食品殺菌中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

英諾克李斯特菌(Listeriainnocua1.2990)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSBYE)、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSAYE)，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉(分析純)、考馬斯亮藍(lán)G250、羅丹明123，北京索萊寶科技有限公司；超微量Na+K+-ATP酶測定試劑盒、超微量Ca2+Mg2+-ATP酶測定試劑盒、鈉離子測定試劑盒、鉀離子測定試劑盒、鎂離子測定試劑盒、鈣離子測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

F-380熒光分光光度計(jì)，天津市福元銘儀器有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，島津儀器有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2F潔凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA2204B電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SCIENTZ-Ⅱ D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；R134A型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1) 菌懸液制備

對真空冷凍干燥的英諾克李斯特菌種進(jìn)行復(fù)蘇與活化，平板劃線培養(yǎng)1 d后獲得單菌落，挑取1個(gè)單菌落于10 mL TSBYE中，搖床培養(yǎng)24 h((36±1) ℃、200 r/min)，以3%接種量接入100 mL的TSBYE液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)12 h((36±1) ℃、200 r/min)，再以3%接種量接入1 000 mL的TSBYE液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)9 h((36±1) ℃、200 r/min)，4 ℃下以8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.85%無菌生理鹽水重復(fù)離心洗滌菌體沉淀3次，調(diào)整菌懸液濃度至108～109CFU/mL，用10 mL離心管分裝。4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2) 電子束輻照處理

電子束輻照在中國原子能科學(xué)研究院的電子加速器上進(jìn)行。參數(shù)為：功率4 kW、能量10 MeV、掃描寬度50 cm、掃描速度1.5 m/min。設(shè)定劑量為0.00、0.75、1.50、2.25、3.00、3.75、5.00 kGy。輻照過程中用經(jīng)中國計(jì)量科學(xué)研究院標(biāo)定的重鉻酸鉀銀劑量計(jì)進(jìn)行劑量跟蹤，實(shí)測劑量為0.00、0.81、1.62、2.23、3.12、3.88、5.14 kGy。

3) 活菌計(jì)數(shù)

各組菌懸液樣品選擇合適的稀釋度用TSAYE采用稀釋平板法，(36±1) ℃下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。平板計(jì)數(shù)操作按照《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》(GB 4789.2—2016)進(jìn)行。

4) 細(xì)胞膜通透性測定

沸水浴(100 ℃下殺菌15 min)菌懸液作為陽性對照，將對照組、輻照組、陽性對照組的菌懸液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，用石英比色皿測定260 mm和280 nm處的吸光度。將陽性對照組的吸光度設(shè)置為100%，其他組的吸光度按比例進(jìn)行換算。

5) 離子泄漏量測定

將對照組、輻照組的菌懸液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液根據(jù)相關(guān)試劑盒說明書測定上清液中Na+、K+、Ca2+、Mg2+的濃度。

6) Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活性測定

將對照組、輻照組的菌懸液樣品在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，棄上清液，沉淀用生理鹽水重懸稀釋為106～107CFU/mL，再對其進(jìn)行超聲破碎(條件為：工作5 s、間歇15 s、共進(jìn)行10 min、功率400 W)。破碎后的樣品參照相關(guān)試劑盒說明書測定酶活性，并采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量。酶活力單位定義為單位時(shí)間(h)單位質(zhì)量(mg)組織蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量。

7) 膜電位測定

將對照組、輻照組的菌懸液加入2 mL終濃度為10 μg/mL的羅丹明123中，37 ℃下避光孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液充分洗凈重懸，用熒光分光光度計(jì)測定菌懸液的平均熒光強(qiáng)度，工作條件為：激發(fā)波長480 nm、發(fā)射波長530 nm、狹縫寬10 nm。

8) 菌懸液pH值測定

用pH計(jì)測定菌懸液的pH值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對活菌數(shù)量的影響

不同輻照劑量下的活菌數(shù)N示于圖1，lgN與輻照劑量的線性擬合方程為y=-1.459x+8.675 2，R2=0.985 1。由圖1可見，lgN由對照組的8.9降至5.00 kGy時(shí)的1.4，各輻照組的活菌數(shù)與對照組相比，P<0.05，有顯著性差異，說明電子束輻照對李斯特菌有明顯的殺菌作用。

D10是指殺死90%微生物所需的輻照劑量，反映的是微生物對輻照的敏感性，其值越大表示微生物對輻照的耐受性越強(qiáng)，反之越敏感。由圖1的線性方程可計(jì)算得電子束輻照對英諾克李斯特菌的D10為0.69 kGy，與Jeong等[13]的結(jié)果一致。Nam等[14]得出豬肉糜中單增李斯特菌的D10為0.58 kGy，這可能是由于所用試驗(yàn)菌種、殺菌介質(zhì)以及初始菌濃度不同導(dǎo)致。

圖1 不同輻照劑量下英諾克李斯特活菌數(shù)量Fig.1 Numbers of Listeria innocua under different irradiation dosages

2.2 電子束輻照對細(xì)胞膜通透性的影響

由于核酸中含有嘌呤、嘧啶堿基，蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)，這些結(jié)構(gòu)都具有共軛雙鍵，所以在紫外光區(qū)具有強(qiáng)烈的光吸收，核酸和蛋白質(zhì)的最大吸收峰分別在260 nm和280 nm附近[15-16]。故可通過測定上清液在260 nm和280 nm處的紫外吸光度來反映紫外吸收物質(zhì)的泄漏量[17]。

圖2 不同輻照劑量下英諾克李斯特菌紫外吸收物質(zhì)的泄漏量Fig.2 Leakage of intracellular UV-absorbing substance from Listeria innocua under different irradiation dosages

電子束輻照處理后，英諾克李斯特菌紫外吸收物質(zhì)的泄漏量示于圖2。沸水浴15 min處理可嚴(yán)重破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜變?yōu)槿感?，因此將對陽性對照組紫外吸收物質(zhì)的泄漏量設(shè)置為100%。由圖2可知，紫外吸收物質(zhì)的泄漏量隨輻照劑量的增加而逐漸增加?？梢姡S著劑量的增加更多的核酸和蛋白質(zhì)泄漏到細(xì)胞外，說明輻照使細(xì)胞膜完整性遭到破壞，通透性增大，失去細(xì)胞生長繁殖所需的蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，這與Fiester等[18]的研究結(jié)果相似。樣品經(jīng)5.00 kGy輻照處理后，核酸類物質(zhì)及蛋白質(zhì)的泄漏量分別為46%和79%，殺菌率已達(dá)99%以上，但泄漏程度與陽性對照組相比均存在顯著差異，P<0.05，說明電子束輻照對英諾克李斯特菌細(xì)胞膜通透性的影響并未達(dá)到熱處理的程度，這可能是由于輻照與熱處理對細(xì)菌細(xì)胞膜的作用途徑及機(jī)理不同。

2.3 電子束輻照對離子泄漏量的影響

不同劑量下細(xì)胞中離子的泄漏量列于表1。由表1可知，除3.75 kGy劑量外，輻照組其他劑量下的菌體胞外Na+離子含量與對照組相比均無顯著性差異，P>0.05，表明并非劑量越高菌體胞外Na+離子濃度越高，這可能是由于鈉鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體的存在，細(xì)菌本身就生長在膜外高鈉的環(huán)境中。隨著輻照劑量的增加，K+、Ca2+、Mg2+離子外泄增多。各輻照組胞外K+、Ca2+的濃度除0.75 kGy外均顯著高于對照組，P<0.05，K+離子從對照組的(0.589±0.031) mmol/L升至5.00 kGy時(shí)的(2.219±0.024) mmol/L，胞外濃度上升了73%；Ca2+離子從對照組的(0.147±0.021) mmol/L升至5.00 kGy時(shí)的(0.543±0.019) mmol/L，胞外濃度也上升了73%；各輻照組胞外Mg2+的濃度均顯著高于對照組，從對照組的(0.014±0.005) mmol/L升至5.00 kGy輻照組的(0.193±0.015) mmol/L，胞外濃度上升了93%，與其他離子濃度的變化趨勢相比，胞外Mg2+的濃度受輻照影響的變化趨勢更明顯。K+、Mg2+離子是維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓平衡的重要無機(jī)鹽離子[19]，Ca2+是胞內(nèi)的一種重要信使，調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖、代謝等細(xì)胞過程[20]，胞內(nèi)離子大量泄漏，離子穩(wěn)態(tài)遭到破壞，最終導(dǎo)致菌體代謝紊亂，加速死亡。

2.4 電子束輻照對Na+K+-ATP酶、Ca2+ Mg2+-ATP酶活性的影響

在細(xì)胞受到脅迫時(shí)，原核生物細(xì)胞膜上的ATP酶活性會(huì)發(fā)生變化[21]。Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶是鑲嵌在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中的一種蛋白質(zhì)，是重要的載體，在維持細(xì)胞容積恒定、細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡等方面發(fā)揮著重要作用，還可為蛋白質(zhì)的合成提供必要的離子濃度，能催化ATP為細(xì)胞供能，為某些物質(zhì)的運(yùn)輸提供驅(qū)動(dòng)力[22]。電子束輻照對Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響列于表2。由表2可知，隨著電子束輻照劑量的增加，英諾克李斯特菌Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活性呈降低的趨勢，0.75 kGy時(shí)，Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶的活性均低于對照組，但影響不顯著，P>0.05。1.50～5.00 kGy時(shí)Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶的活性均顯著低于對照組，P<0.05，且Ca2+Mg2+-ATP酶活性的變化趨勢較Na+K+-ATP酶的更明顯，這可能是由于Ca2+Mg2+-ATP酶對輻照較為敏感造成的。Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶不同程度的失活，使細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞等正常生理代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Méze?ová等[23]和Matsuda等[24]均發(fā)現(xiàn)經(jīng)過射線處理，細(xì)胞中Na+K+-ATP酶的活性顯著降低，造成陽離子的主動(dòng)運(yùn)輸減少、陽離子泵受到損害。

表1 不同輻照劑量下英諾克李斯特菌離子的泄漏量Table 1 Leakage of intracellular ion from Listeria innocua under different irradiation dosages

表2 不同輻照劑量下英諾克李斯特菌細(xì)胞膜ATPase的活性Table 2 Cell membrane ATPase activity of Listeria innocua under different irradiation dosages

2.5 電子束輻照對膜電位的影響

圖3 不同輻照劑量下英諾克李斯特菌的膜電位Fig.3 Membrane potential of Listeria innocua under different irradiation dosages

膜電位是細(xì)胞膜內(nèi)外兩邊的電位差[25-26]，具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)及代謝旺盛的細(xì)菌，細(xì)胞膜內(nèi)外存在一定的電位差[27]。如果膜電位降低說明細(xì)胞發(fā)生了去極化，反之，說明細(xì)胞發(fā)生了超極化[28]。熒光強(qiáng)度大小可反映膜電位的變化，電子束輻照對英諾克李斯特菌膜電位的影響示于圖3。由圖3可知，對照組菌懸液的平均熒光強(qiáng)度為413.375±4.830，隨著輻照劑量的增加，膜電位迅速下降，0.75 kGy的電子束輻照使菌懸液的平均熒光強(qiáng)度下降10%，與對照組相比存在顯著性差異，P<0.05，經(jīng)過5.00 kGy的電子束輻照，菌懸液的平均熒光強(qiáng)度下降70%，膜電位下降的趨勢與胞內(nèi)離子的泄漏量趨勢相一致。

2.6 電子束輻照對菌懸液pH值的影響

pH值變化一直被認(rèn)為是微生物致死的一個(gè)重要因素[29]，菌懸液pH值降低會(huì)造成微生物新陳代謝的酶失活，進(jìn)而導(dǎo)致微生物死亡。不同劑量下英諾克李斯特菌菌懸液的pH值示于圖4。從圖4可看出，經(jīng)過5.00 kGy的電子束輻照處理后，菌懸液pH值從6.24±0.17下降到5.43±0.04。說明電子束輻照顯著降低了菌懸液的pH值，這與顧春暉等[30]的研究結(jié)果一致。這主要是由于輻照過程發(fā)生了H2O→e-aq(2.6)+H·(0.55)+OH·(2.7)+H2(0.45)+H2O2(0.71)+H3O+(2.6) 反應(yīng)，該反應(yīng)產(chǎn)生了大量的H3O+[31]，這一方面會(huì)引起菌懸液pH值的下降，另一方面OH·、H·、e-aq會(huì)與胞內(nèi)大分子物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，致使大分子物質(zhì)變性，如會(huì)導(dǎo)致DNA單鏈和雙鏈片段的形成，引起DNA構(gòu)象的整體變化[32]。

圖4 不同輻照劑量下英諾克李斯特菌菌懸液的pH值Fig.4 pH of Listeria innocua suspension under different irradiation dosages

3 結(jié)論

1) 電子束輻照可有效殺滅英諾克李斯特菌，劑量越高，殺菌效果越好，其D10為0.69 kGy。

2) 電子束輻照使英諾克李斯特菌細(xì)胞膜通透性增大，導(dǎo)致紫外吸收物質(zhì)大量泄漏，胞內(nèi)離子泄漏結(jié)果也表明一定劑量輻照后英諾克李斯特菌細(xì)胞膜完整性被破壞，且離子穩(wěn)態(tài)被瓦解。

3) 電子束輻照后，英諾克李斯特菌Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活性降低，膜電位及菌懸液pH值也發(fā)生了一定程度的改變，表明輻照后李斯特菌胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換等正常生理代謝發(fā)生紊亂。

綜上可知，電子束輻照對英諾克李斯特菌生理特性有著顯著的影響，這可能是導(dǎo)致其死亡的重要原因，有關(guān)死亡機(jī)理的研究還有待于進(jìn)一步深入。